消瘤平體內(nèi)外對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長及凋亡相關(guān)蛋白的影響

付盈盈，司應(yīng)明*，李 林，李瑞生

消瘤平體內(nèi)外對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長及凋亡相關(guān)蛋白的影響

付盈盈1，司應(yīng)明1*，李 林1，李瑞生2

目的 研究消瘤平體內(nèi)外對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的影響，以及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Fas和Survivin含量的影響。方法 常規(guī)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，加入不同濃度的消瘤平，MTT法分別檢測培養(yǎng)3個(gè)時(shí)段后對(duì)細(xì)胞生長的影響。HeLa細(xì)胞接種于BALB/C-nu裸鼠，隨機(jī)分為5組，陰性對(duì)照組、5-fu陽性對(duì)照組以及消瘤平3個(gè)劑量組，另設(shè)空白對(duì)照組，觀察荷瘤裸鼠的一般狀況。腹腔注射給藥4周后，取瘤塊和脾臟，稱重計(jì)算抑瘤率和脾臟指數(shù)。取血，免疫組化法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Fas、Survivin蛋白的含量。結(jié)果 消瘤平體內(nèi)外均能抑制HeLa細(xì)胞的生長；體內(nèi)可明顯增加荷瘤裸鼠的脾臟指數(shù)；中、高劑量的消瘤平可促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2和Survivin的表達(dá)，高劑量的消瘤平還促進(jìn)Fas的表達(dá)。結(jié)論 消瘤平抗宮頸癌的作用機(jī)制與抑制HeLa細(xì)胞增殖，以及Bcl-2、Bax、Fas和Survivin基因蛋白誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)。

消瘤平；HeLa細(xì)胞；增殖；凋亡；Bcl-2；Bax；Fas；Survivin

0 引言

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，并逐年上升，具有年輕化趨勢[1]。目前，放、化療及手術(shù)是惡性腫瘤的主要治療方法[2-3]，但由于中晚期癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，放、化療及手術(shù)治療的效果并不理想；并且放化療選擇性差，會(huì)損傷正常的組織和細(xì)胞，其毒副作用常使患者難以忍受，從而放棄導(dǎo)致治療失敗[4]。中藥在癌癥的治療中既能扶正以增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，又能殺傷癌細(xì)胞，對(duì)機(jī)體的毒副作用較小[5]。因此，尋找不良反應(yīng)小、對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性高的天然抗腫瘤藥物已成為重要研究目標(biāo)。消瘤平是本實(shí)驗(yàn)室采用水煎法制得的糖漿劑，由柴胡、黃芩、黨參、炙甘草、大棗、法半夏6味中藥材組成，HPLC測得其主要成分黃芪苷含量為2.41 mg/mL，具有增強(qiáng)免疫功能和抗腫瘤的作用，在腫瘤輔助治療中具有一定的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)試圖研究消瘤平對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制，以期為消瘤平治療宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及理論依據(jù)。

1 材料與儀器

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。SPF級(jí)BALB/C-nu裸鼠，體重16～20 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心，合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005，飼養(yǎng)于SPF級(jí)無菌環(huán)境中，用高壓滅菌處理的飲用水和飼料喂養(yǎng)。消瘤平為本實(shí)驗(yàn)室提取制備，批號(hào)：130411。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；超凈工作臺(tái)(中國吳江市凈化設(shè)備總廠)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Bc1-2、Bax、Fas和Survivin抗體(南京凱基公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，取處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞棄去原培養(yǎng)液，以PBS洗滌1～2次，然后用胰蛋白酶消化，離心后加入新培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度。

2.2 MTT法檢測消瘤平對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用 將調(diào)整好濃度的HeLa細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的消瘤平(用1 640培養(yǎng)液溶解，最終每組含消瘤平濃度分別為：10、20、40、80、160、320 μg/mL)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔吸出100 μL上清棄去，加入5 g/L MTT 20 μL，4 h后，加入100 μL DMSO，微量振蕩器振蕩使充分溶解，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測，按公式“(1-藥物孔A值/對(duì)照孔A值)×100%”計(jì)算藥物的體外生長抑制率，以劑量和抑制率繪制生長曲線。

2.3 裸鼠移植瘤模型的建立、分組及給藥 將對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞配制成1×107/mL單細(xì)胞懸液。取4～6周齡的BALB/C-nu裸鼠，無菌下將細(xì)胞接種于右側(cè)腋窩皮下，致瘤后，以瘤塊移植傳代，4代后可用于實(shí)驗(yàn)研究。取出皮下移植瘤，剪切后接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，待成瘤后將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成5組，每組6只，分別按以下劑量進(jìn)行給藥：陰性對(duì)照組灌胃生理鹽水；5-Fu陽性對(duì)照組腹腔注射5-Fu 25 mg/kg；消瘤平低劑量組灌胃消瘤平20 mg/kg；消瘤平中劑量組灌胃消瘤平40 mg/kg；消瘤平高劑量組灌胃消瘤平80 mg/kg，每周給藥3次，每次0.2 mL，各組均連續(xù)給藥4周。

2.4 消瘤平對(duì)荷HeLa細(xì)胞裸鼠瘤塊的生長和免疫器官的影響 末次給藥24 h后，脫頸椎處死裸鼠，剝離瘤塊和脾臟，分析天平稱重，計(jì)算各組抑瘤率和脾臟指數(shù)。并取部分移植瘤組織經(jīng)DEPC水處理后，置入凍存管中，保存于液氮瓶。

腫瘤抑制率(%)=[1-(治療組平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重)]×100%

脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Fas、Survivin含量的變化 取“2.4”項(xiàng)下凍存的腫瘤組織，用10%的中性緩沖甲醛固定10～12 h，無水酒精脫水l h，重復(fù)3次，二甲苯透明化處理，于65 ℃以下浸蠟及包埋，切片。置60 ℃溫箱中垂直烤片。切片脫蠟至水，加入3% H2O2于室溫下滅活內(nèi)源性酶；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)進(jìn)行熱修復(fù)抗原；5% BSA封閉液；再分別滴加Bcl-2、Bax、Fas、Survivin抗體，用PBS (pH=7.4)洗3次；滴加IgG，PBS (pH=7.4)洗3次；再滴加SABC，PBS (pH=7.4)洗4次，顯色，HE染色，脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。采用Image.Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算積分吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用 將96孔板于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞生長旺盛，經(jīng)消瘤平作用的細(xì)胞排列稀疏。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度的消瘤平對(duì)HeLa細(xì)胞的生長均有一定的抑制作用，各濃度組細(xì)胞生長抑制率與同一板的空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同板之間，同一濃度組的抑制率隨著作用時(shí)間的延長而增大。表明消瘤平體外可抑制HeLa細(xì)胞的生長，且抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。見圖1。

3.2 荷瘤裸鼠的一般情況 接種5 d后，可見接種部位有實(shí)性小結(jié)節(jié)，隨后結(jié)節(jié)逐漸增大。給藥期間，各組裸鼠的一般狀態(tài)均良好、皮膚紅潤，給藥組食欲和活動(dòng)量與對(duì)照組無明顯差異。

3.3 對(duì)荷瘤裸鼠移植瘤生長的抑制作用 25 mg/kg 5-Fu腹腔注射給藥明顯抑制荷瘤裸鼠瘤塊生長，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；消瘤平3個(gè)劑量(20、40、80 mg/kg)灌胃給藥均可抑制裸鼠瘤質(zhì)量的增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，腫瘤抑制率具有濃度依賴性。見表1。

圖1 消瘤平對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用

3.4 對(duì)荷瘤裸鼠脾臟指數(shù)的影響 5-Fu組荷瘤裸鼠的脾臟指數(shù)給藥后明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；40、80 mg/kg劑量消瘤平可明顯增加荷瘤裸鼠的脾臟指數(shù)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 消瘤平對(duì)荷瘤裸鼠瘤質(zhì)量、脾臟指數(shù)的影響(n=6)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.5 對(duì)凋亡相關(guān)基因蛋白Bcl-2、Bax、Fas、Survivin表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，5-Fu可顯著促進(jìn)Bax的表達(dá)(P<0.01)，抑制Survivin的表達(dá)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中、高劑量組的消瘤平可明顯促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2和Survivin的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；高劑量組的消瘤平還可促進(jìn)Fas的表達(dá)。見表2。

表2 消瘤平對(duì)荷瘤裸鼠Bax、Bcl-2、Fas、Survivin蛋白表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均很高。近年來，天然藥物在腫瘤治療過程中具有顯著成效，除了減輕放化療導(dǎo)致的毒副反應(yīng)，還提高腫瘤患者的生活質(zhì)量，延長生存期[6]。大多數(shù)藥物主要通過兩種途徑達(dá)到抗腫瘤的作用，即抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[7]。而抑制細(xì)胞增殖的作用又和機(jī)體的免疫機(jī)制有密切關(guān)系[8]。消瘤平由柴胡、黃芩、黨參、炙甘草、大棗、法半夏6味中藥材組成。柴胡和解少陽，疏肝解郁，升舉陽氣，通達(dá)表里；黨參和大棗補(bǔ)中益氣，黨參健脾益肺，大棗養(yǎng)血安神；黃芪健脾益氣，驅(qū)風(fēng)運(yùn)毒；法半夏調(diào)和肝胃(脾)，炙甘草調(diào)和諸藥，提高免疫功能。同時(shí)，柴胡歸屬肝經(jīng)，可調(diào)節(jié)肝經(jīng)的功能以助生血[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測消瘤平體外對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，以及在移植瘤模型裸鼠體內(nèi)對(duì)HeLa腫瘤的作用，結(jié)果表明，消瘤平體內(nèi)外均能抑制HeLa細(xì)胞，這種抑制作用具有劑量依賴性；消瘤平還增加荷瘤裸鼠的脾臟指數(shù)，表明其抗宮頸癌的作用與提高荷瘤機(jī)體免疫功能有一定關(guān)系。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在外界環(huán)境的影響下，為了更好地適應(yīng)環(huán)境，在一系列基因的調(diào)控下進(jìn)行的主動(dòng)自殺過程，是維持機(jī)體自身穩(wěn)定重要的調(diào)節(jié)機(jī)制，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系緊密[11]。在正常生物體內(nèi)，細(xì)胞增殖和凋亡處于平衡狀態(tài)，這種平衡一旦被打破，就會(huì)造成包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生。近年來，隨著對(duì)細(xì)胞因子研究的不斷發(fā)展，在凋亡發(fā)生過程中一些特定的基因起著舉足輕重的作用，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系也成為研究的熱點(diǎn)[12]。

Bcl-2家族基因廣泛分布于生物體內(nèi)，其表達(dá)的Bcl-2蛋白家族包括抑制細(xì)胞凋亡的抗凋亡蛋白Bcl-2和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的促凋亡蛋白Bax。Bcl-2是由239個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在腫瘤組織中高度表達(dá)，但也表達(dá)于某些正常組織如黏膜細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。Bcl-2可通過改變線粒體膜巰基的氧化還原狀態(tài)，控制其膜電位以調(diào)控細(xì)胞凋亡[13-14]。當(dāng)細(xì)胞受到死亡信號(hào)刺激后，Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax在蛋白酶作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，與Bcl-2形成異源二聚體，從而抑制Bcl-2，使其喪失抑制凋亡的作用，引起細(xì)胞器功能喪失和各種促凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。Bcl-2/Bax比例失調(diào)是腫瘤發(fā)生的原因之一。Fas屬于TNF和NGF跨膜受體超家族成員，廣泛分布于人體組織中，在與其受體Fasl/CD95L結(jié)合后導(dǎo)致空間構(gòu)象發(fā)生改變，并可誘導(dǎo)激活誘導(dǎo)Caspase家族，啟動(dòng)蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[16]。Survivin是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成員，含有一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，可與紡錘體微管蛋白特異性結(jié)合抑制細(xì)胞凋亡[17]。Survivin在大多數(shù)腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)，而在健康人的機(jī)體組織中并不存在。Survivin能干擾Fas、Bax、Caspase等因子誘導(dǎo)的凋亡，從而發(fā)揮抗凋亡功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，消瘤平中、高劑量組可明顯促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2和Survivin的表達(dá)，而高劑量組的消瘤平還可促進(jìn)Fas的表達(dá)。綜上，可以推測消瘤平抗宮頸癌的作用與抑制HeLa細(xì)胞增殖、提高機(jī)體免疫功能和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，而誘導(dǎo)凋亡的作用又與Bcl-2、Bax、Fas和Survivin有密切關(guān)系，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路十分復(fù)雜，可能還涉及其他的凋亡基因蛋白，尚需進(jìn)一步研究。

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Effect of Xiao liuping on human cervical carcinoma HeLa cells growth and apoptosis-related proteinsinvivoandinvitro

FU Ying-ying1,SI Ying-ming1*,LI Lin1,LI Rui-sheng2

(1.Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xiangyang 441000,China; 2.Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441021,China)

Objective To investigate the effect of Xiao liuping on growth and the apoptosis-related protein Bcl-2,Bax,Fas and survivin content of human cervical carcinoma HeLa cells.Methods Cells were cultivatedinvitro,HeLa cells in culture mediuminvitrowere given with different concentrations of Xiao liuping,the inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay.HeLa cells were seeded in BALB/C-nu mice,the tumor-bearing nude mice were divided into 5 groups randomly: control group,5-Fu group,Xiao liuping three doses groups,and the blank control group was set,the general condition of nude mice was observed.After 4 weeks,the tumor and spleen weight was determined,the tumor-inhibition rate and spleen index were calculated.The expression of apoptosis-related proteins Bcl-2,Bax Fas and Survivin in blood were determined by immunohistochemistry.Results Xiao liuping inhibited the proliferation of HeLa cellsinvitroandinvivo,increased the spleen index of nude mice significantly,the medium and high doses of Xiao liuping promoted the expression of Bax,and inhibited the expression of Bcl-2 and Survivin,high dose of Xiao liuping promoted the expression of Fas.Conclusion The anti-tumor mechanism of Xiao liuping related to the inhibition of the proliferation,as well as Bcl-2,Bax,Fas and Survivin induced apoptosis.

Xiao liuping; HeLa; Proliferation; Apoptosis; Bcl-2; Bax; Fas; Survivin

2014-08-28

1.襄陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 襄陽 441000，2.襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201504005