不同休眠玉米種子內(nèi)源激素的含量測定和分析

吳元奇，冷亦峰，夏超，周樹峰，蘭海*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所,農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學與遺傳育種重點實驗室，四川 成都 611130；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院作物所，四川 成都610066)

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不同休眠玉米種子內(nèi)源激素的含量測定和分析

吳元奇1，冷亦峰2，夏超1，周樹峰1，蘭海1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所,農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學與遺傳育種重點實驗室，四川 成都 611130；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院作物所，四川 成都610066)

本研究利用高效液相色譜法，對7個不同休眠性的玉米自交系鮮種子內(nèi)源激素ZT、GA3、IAA和ABA的含量進行了測定和分析。分析了各種激素及其相互作用對玉米種子休眠的影響，為闡明玉米種子休眠機理奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果表明，ZT含量在一定程度上與種子休眠性呈負相關(guān)性，具有對種子萌發(fā)抑制物的拮抗作用；GA3具有解除休眠和促進萌發(fā)的功能，在種子萌發(fā)過程中是必需的；IAA與休眠不具有相關(guān)性；ABA具有拮抗GA3的作用，誘導種子休眠，抑制萌發(fā)。種子的休眠是幾種激素綜合作用的結(jié)果，種子休眠程度與種子內(nèi)起促進作用和起抑制作用的激素之間的比例密切相關(guān)。強休眠特性玉米自交系具有以下特征：ZT和GA3含量低,ABA含量高,ZT/ABA值與GA3/ABA值較小，各激素相對平衡。

玉米；種子休眠；內(nèi)源激素；高效液相色譜

休眠在自然界普遍存在。種子休眠性是一種在植物系統(tǒng)發(fā)育演化進程中形成的生物學特征，并涉及種子萌發(fā)過程中一系列復雜的基因表達與調(diào)控[1-2]。種子休眠是指在適宜環(huán)境條件下具有生活力的種子不發(fā)芽或延遲發(fā)芽的現(xiàn)象[3-4]，受到種子內(nèi)在因素和外部條件共同影響[5-7]。目前普遍認為皮層吸水障礙、胚休眠和種子內(nèi)存在抑制萌發(fā)物質(zhì)是種子休眠的三大原因[8]。種子休眠性是植物學研究的根本性問題之一，長期以來，眾多學者對其調(diào)控機理進行了廣泛的探索和描述，形成了多種假說，其中內(nèi)源激素學說[9]被廣泛認可。內(nèi)源激素學說認為休眠決定于萌發(fā)抑制物與促進物的綜合作用，而并非單獨取決于某種內(nèi)源激素的含量高低。Khan[10]進一步發(fā)展了該假說，提出了調(diào)控種子萌發(fā)與休眠的“三因子學說”。即赤霉素(GA)、細胞分裂素(CTK)和萌發(fā)抑制物(如ABA)是與種子萌發(fā)與休眠緊密相關(guān)的首要因子，其中任何一種激素的缺失都可能指示種子萌發(fā)或者停留在休眠階段。GA具有促進萌發(fā)、打破休眠的作用，能解除基因的抑制作用，產(chǎn)生編碼水解相關(guān)酶類的特定mRNA[11-12]。GA在種子萌發(fā)調(diào)控中起“原初作用”。 CTK能克服天然抑制物對種子萌發(fā)的抑制作用，與抑制物具有對抗作用[13-14]。CTK在種子萌發(fā)調(diào)控中起“解抑作用”。 ABA一般被認為是天然的萌發(fā)抑制劑，ABA具有阻礙萌發(fā)、維持休眠的作用，能抑制核酸正常代謝，干擾RNA的合成從而阻礙蛋白質(zhì)和水解相關(guān)酶類的合成[15]。ABA對種子萌發(fā)起“抑制作用”?！叭蜃訉W說”對種子休眠與萌發(fā)過程中內(nèi)源激素的相互作用做出了很好的解釋，目前被人們廣泛接受。

玉米(Zeamays)種子休眠性是重要的農(nóng)藝性狀[16-18]。加之我國西南部分地區(qū)氣候多雨寡照，玉米果穗發(fā)芽危害十分嚴重，對玉米生產(chǎn)造成了極大的損失。因此，迫切需要深入研究玉米休眠機理，以減少玉米生產(chǎn)上的穗發(fā)芽危害。本實驗以7個不同休眠性的玉米自交系為材料，通過對內(nèi)源激素含量的測定、比較和分析，探討了不同玉米自交系之間種子休眠性與內(nèi)源激素的內(nèi)在關(guān)系，為進一步研究和利用優(yōu)良的抗穗發(fā)芽種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1供試材料

由四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所選育的7個不同休眠性玉米自交系：R08、9LY05010、9LY05080、A318、9LY05041、9LY05082、9LY05028。其中R08表現(xiàn)強休眠性；A318休眠性最弱，穗發(fā)芽現(xiàn)象嚴重；其他5個自交系為新選自交系。2010年田間種植于雅安市雨城區(qū)多營農(nóng)場。

1.2方法

所有自交系嚴格套袋自交授粉35 d后取樣。隨機收獲3株玉米果穗，剝?nèi)⌒迈r玉米籽粒并采用高效液相色譜法(HPLC)測定玉米種子內(nèi)源激素ZT、GA3、IAA和ABA的含量。整個實驗在弱光下進行，設3個重復。

稱取1.0 g左右玉米籽粒放到預冷的研缽中，加入15 mL預冷的80%甲醇，冰浴環(huán)境下研磨成勻漿。4℃下浸提12 h，于4℃環(huán)境下5000 r/min 離心15 min。上清液于4℃冰箱中保存。沉淀用10 mL 80%甲醇浸提3次，重復上述離心步驟，收集并合并全部浸提液。36℃下將提取液再減壓濃縮至10 mL，加入等體積石油醚，重復若干次至石油醚無色，棄去上層相石油醚。取出下層甲醇相減壓濃縮至水相，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至2.8～3.0。加入等體積乙酸乙酯萃取，重復3次，合并乙酸乙酯萃取液，保留下層水溶液。上層乙酸乙酯液在40℃下減壓蒸干，用95%乙醇溶解沉淀待測。下層水溶液用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，加入等體積正丁醇萃取3次，70℃下減壓蒸干正丁醇萃取液，用95%乙醇溶解沉淀待測。

色譜柱：Hypersil ODS C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.6%冰乙酸+甲醇，梯度洗脫(表1)；柱溫：35℃；進樣量10 μL；流速：0.8 mL/min；紫外檢測波長：254 nm；定量方法：外標校準曲線法。

1.3統(tǒng)計分析

采用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution of HPLC

2 結(jié)果與分析

本試驗選取7個不同休眠性的玉米自交系鮮種子，測定了其內(nèi)源激素ZT(玉米素)、IAA、GA3及ABA的含量。4種激素標準曲線相關(guān)性為：ZT：y=26806x，R2=0.997；IAA：y=12852x，R2=0.998；GA3：y=276.4x，R2=0.983；ABA：y=55948x，R2=0.999。

2.1ZT含量測定

圖1 不同玉米自交系種子中ZT含量比較

圖2 不同玉米自交系種子中GA3含量比較

由圖1可知，不同休眠性玉米自交系鮮種子中，A318種子內(nèi)ZT含量最高，為72.3 μg/g； R08含量最低，為10.2 μg/g；其他5個自交系的ZT含量表現(xiàn)為：9LY05028>9LY05041>9LY05010>9LY05080>9LY05082，變化范圍為11.8～31.5 μg/g。以強休眠性R08為對照，6個自交系分別高出A318：607.26%；9LY05028：208.49%；9LY05041：134.57%；9LY05010： 86.72%；9LY05080：65.62%；9LY05082：15.17%。不同自交系間ZT含量的多重比較表明，除R08和9LY05082、9LY05080和9LY05010之間差異不顯著外，其余各自交系之間均達差異顯著水平。

2.2GA3含量測定

由圖2可知，不同休眠性玉米自交系鮮種子中，9LY05080種子內(nèi)GA3含量最高，為350.93 μg/g；R08含量最低，為38.69 μg/g；其他5個自交系的GA3含量表現(xiàn)為：9LY05041>9LY05082>9LY05028>A318>9LY05010，變化范圍為105.69～250.84 μg/g。以強休眠性R08為對照，其余6個自交系分別高出9LY05080：806.00%；9LY05041：548.25%；9LY 05082：460.84%；9LY05028：282.80%；A318:180.17%；9LY05010：173.13%。不同自交系間GA3含量多重比較表明，除9LY05010、A318和9LY05028之間,9LY05082和9LY05041之間差異不顯著外，其余各自交系之間均達差異顯著水平。

2.3IAA含量測定

由圖3可知，不同休眠性玉米自交系鮮種子中，9LY05028種子內(nèi)IAA含量最高，為13.74 μg/g；9LY05041含量最低，為6.01 μg/g；其他5個自交系的IAA含量表現(xiàn)為：9LY05010>9LY05080>9LY05082>R08>A318，變化范圍為6.83～11.35 μg/g。以強休眠性R08為對照，其余6個自交系分別高出9LY05028：92.69%；9LY05010：59.20%；9LY05080：27.78%；9LY05082：14.44%；A318：-4.20%；9LY05041：-15.76%。不同自交系間多重比較結(jié)果表明，除9LY05010、A318、R08和9LY05082之間差異不顯著，其余各自交系之間均達差異顯著水平。

2.4ABA含量差異

由圖4可知，不同休眠性玉米自交系鮮種子中，9LY05028種子內(nèi)ABA含量最高，為65.44 μg/g；9LY05041含量最低，為5.01 μg/g；其他5個自交系的ABA含量表現(xiàn)為：A318>R08>9LY05082>9LY05010>9LY05080，變化范圍為5.78～46.67 μg/g。以強休眠性R08為對照，其余6個自交系分別高出9LY05028：186.57%；A318：104.37%；9LY05082：-15.12%；9LY05010：-26.75%；9LY05080：-74.69%；9LY05041：-78.06%。不同自交系間多重比較結(jié)果表明，除9LY05041、9LY05080和9LY05010之間，9LY05080、9LY05010和9LY05082之間差異不顯著，其余各自交系之間均達差異顯著水平。

圖3 不同玉米自交系種子中IAA含量比較

圖4 不同玉米自交系種子中ABA含量比較

2.5ZT/ABA、GA3/ABA、IAA/ABA差異

圖5 不同玉米自交系種子中ZT/ABA、GA3/ABA、IAA/ABA比較

根據(jù)4種內(nèi)源激素含量測定結(jié)果，分別計算ZT/ABA、GA3/ABA和IAA/ABA。圖5表明，在7個玉米自交系中，R08的ZT/ABA最小，9LY05041的最大。R08的GA3/ABA最小，9LY05080最大。A318的IAA/ABA最小，R08僅次于A318，位列倒數(shù)第二小，9LY05080最大。

3 討論與結(jié)論

3.1ZT與休眠性強弱

目前已知高等植物中的細胞分裂素大多是玉米素(ZT)，它集中分布于代謝旺盛的器官中，如萌發(fā)的種子、根尖及莖尖中。ZT具有調(diào)節(jié)種子營養(yǎng)物質(zhì)代謝，刺激細胞分裂和膨大，促進果實生長的生理作用。

本實驗中，強休眠性自交系R08種子中ZT含量最低，強穗發(fā)芽自交系A(chǔ)318種子中ZT含量最高，5個具有部分穗發(fā)芽的新選自交系中ZT含量位于中間，這說明ZT含量在一定程度上與種子休眠性呈負相關(guān)性，這與前人的研究較為一致[19-21]。在自交系A(chǔ)318和9LY05028種子中ABA含量很高，但其休眠性很弱，其原因應該是種子中存在較高的ZT。ZT具有對種子萌發(fā)抑制物的拮抗作用，解除了ABA對種子萌發(fā)的阻礙，使其穗發(fā)芽現(xiàn)象大大增加，這與Khan[10]提出的三因子學說中的“解除抑制作用”是一致的。

3.2GA3與休眠性強弱

赤霉素是一類具有解除休眠和促進萌發(fā)功能的生長激素，有利于激活種子內(nèi)代謝相關(guān)酶的活性，使種子能夠順利萌發(fā)。GA3是一類活性較強的赤霉素，它能夠促進植物生長，促進細胞伸長和分裂，對促進種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)種子發(fā)育有十分重要的作用。

在本實驗中，強休眠性自交系R08中GA3含量最低，其余自交系中GA3濃度均高于R08。隨著GA3含量的增加，自交系休眠性逐漸降低，穗發(fā)芽現(xiàn)象逐漸嚴重，這說明GA3與種子萌發(fā)密切相關(guān)，這與前人的研究是一致的[22-24]。種子從休眠進入萌發(fā)的過程中，種子內(nèi)部物質(zhì)要經(jīng)過一系列生理生化反應。GA3被認為參與調(diào)節(jié)這些生理過程，促進大分子物質(zhì)降解，產(chǎn)生多種水解酶，使貯藏蛋白水解。同時加快胚軸和胚乳中的物質(zhì)合成，為種子萌發(fā)提供必要的物質(zhì)合成和能量基礎(chǔ)[25-28]。此外，Koornneef等[29]及Groot和Karssen[30]對擬南芥(Arabidopsisthaliana)和番茄(Solanumlycopersicum)赤霉素缺失突變體進行了研究，發(fā)現(xiàn)缺乏赤霉素的突變體種子不能夠完成萌發(fā)，在施加外源赤霉素后正常萌發(fā)。這說明赤霉素在種子萌發(fā)過程中是必需的。

3.3IAA與休眠性強弱

植物整個發(fā)育過程，從胚胎形成到種子發(fā)育、細胞分化到器官形成，整個過程都受到IAA的調(diào)控[31-32]，植物種子休眠性顯然也與IAA相關(guān)。IAA在植物中具有促進植物細胞分化和伸長，增加細胞體積和重量的生理作用，調(diào)節(jié)植物性別分化、果實形成和脫落、種子休眠等生理過程。

本實驗中IAA含量在強休眠性自交系R08中含量較低，但與無休眠自交系A(chǔ)318、部分休眠自交系9LY05010和9LY05082之間的IAA含量差異不顯著，且從7個自交系整體來看，IAA與休眠不具有相關(guān)性，這是支持Khan[10]“三因子學說”的[33]。

3.4ABA與休眠性強弱

ABA廣泛存在于高等植物各器官中，在植物胚胎發(fā)生、種子發(fā)育和蛋白質(zhì)合成過程中具有重要作用。ABA具有拮抗GA的作用，通過抑制DNA和RNA合成，改變某些酶的活性，從而誘導種子休眠，抑制萌發(fā)[32]。

在本實驗中，強休眠性自交系R08種子中ABA含量高居第三，高于9LY05010、9LY05080、9LY05041和9LY05082等具有部分穗發(fā)芽特性的自交系，這與前人的研究是一致的[1,10,31]。但在自交系A(chǔ)318和9LY05028中并不能體現(xiàn)這種規(guī)律，其ABA含量較高，但穗發(fā)芽現(xiàn)象十分嚴重，可能與這兩個自交系中較高的ZT含量有關(guān)。由此不難看出，種子的休眠并不只是單單與某一激素的含量相關(guān)，而是幾種激素綜合作用的結(jié)果。

3.5激素平衡與休眠性強弱

種子休眠并不是由單獨某個基因或者某一單獨物質(zhì)調(diào)控的，而是一個極其復雜的生理調(diào)控過程。種子休眠程度與種子內(nèi)各激素的平衡密切相關(guān)，尤其與起促進作用和起抑制作用的激素之間的比例及平衡關(guān)系更為密切。例如，GA與ABA是具有拮抗作用的發(fā)芽促進物與發(fā)芽抑制物[1,23]，其比值高則種子解除休眠，解除萌發(fā)；比值低則抑制萌發(fā)，維持休眠。

本實驗中，自交系R08的ZT/ABA值和GA3/ABA值都為最小，其IAA/ABA值也僅大于A318而小于其余5個自交系。由此可以看出，R08鮮種子中抑制萌發(fā)物質(zhì)占據(jù)優(yōu)勢，因而表現(xiàn)強休眠性。此外，R08的ZT/ABA值、GA3/ABA值均最小，說明R08種子內(nèi)各激素比例平衡，因而表現(xiàn)優(yōu)良的抗穗發(fā)芽性狀。自交系9LY05028的ZT/ABA值、GA3/ABA值均較小，但其ZT含量高居第二，GA3含量高居第四，促進萌發(fā)物質(zhì)絕對含量較大，故在田間表現(xiàn)為不能抗穗發(fā)芽。自交系A(chǔ)318的GA3/ABA值較小，但ZT/ABA值高居第三，各激素比值之間相差很大，說明其籽粒中各激素比例不平衡，因而在田間表現(xiàn)為不能抗穗發(fā)芽。

3.6自交系R08的強休眠模式

玉米自交系R08種子具有強休眠性，在收獲以后需要一段時間的生理后熟才能順利萌發(fā)。根據(jù)本實驗在R08新鮮種子中測得的各激素含量及其比值，通過與其他不同休眠特性玉米自交系的比較，可以總結(jié)出具有強休眠特性玉米自交系的一般特征，即：ZT含量和GA3含量低；ABA含量高；ZT/ABA值與GA3/ABA值均較小，各激素相對平衡。上述特征可為篩選新的抗穗發(fā)芽優(yōu)良種質(zhì)提供參考標準。

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Comparative analysis of endogenous hormones in maize seeds with different dormancy characteristics

WU Yuan-Qi1, LENG Yi-Feng2, XIA Chao1, ZHOU Shu-Feng1, LAN Hai1*

1.MaizeResearchInstitute,KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofMaizeinSouthwestRegion,MinistryofAgriculture,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China； 2.CropResearchInstitute,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Chengdu610066,China

A study has been undertaken to clarify maize seed dormancy mechanisms.Four endogenous hormones-zeatin (ZT), gibberellins (GA3), indole acetic acid (IAA) and abscisic acid (ABA) in 7 maize inbred lines with diverse dormancy characteristics were measured and analysed by HPLC.We analysed the effect of the four endogenous hormones on seed dormancy, including their interaction.Results indicated that ZT content was negatively correlated with seed dormancy, with an antagonism to germination inhibitors.GA3is necessary for germination and can help break dormancy.IAA has no correlation with seed dormancy.ABA promoted dormancy and inhibited germination, with an antagonism to GA3.Furthermore, seed dormancy was closely related to the proportion of the four hormones.Maize inbred lines with strong dormancy had the following traits:low content of ZT and GA3, high content of ABA, low values of ZT/ABA and GA3/ABA, and balanced hormone content.

maize (Zeamays); dormancy; endogenous hormones; HPLC

10.11686/cyxb2015136

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-03-11；改回日期：2015-06-29

國家“863”計劃(2011AA10A103)和四川省科技廳應用基礎(chǔ)項目(2014jy0048)資助。

吳元奇(1968-)，男，重慶酉陽人，副教授。E-mail:wuyuanqi@hotmail.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:lanhai_maize@163.com

吳元奇, 冷亦峰, 夏超, 周樹峰, 蘭海.不同休眠玉米種子內(nèi)源激素的含量測定和分析.草業(yè)學報, 2015, 24(12):213-219.

WU Yuan-Qi, LENG Yi-Feng, XIA Chao, ZHOU Shu-Feng, LAN Hai.Comparative analysis of endogenous hormones in maize seeds with different dormancy characteristics.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):213-219.