短芒大麥草青貯微生物特性研究及優(yōu)良乳酸菌篩選

陶雅，李峰，高鳳芹，孫啟忠*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.農(nóng)業(yè)部牧草資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

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短芒大麥草青貯微生物特性研究及優(yōu)良乳酸菌篩選

陶雅1,2，李峰1，高鳳芹1,2，孫啟忠1,2*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.農(nóng)業(yè)部牧草資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

以短芒大麥草為研究對(duì)象，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從葉圍和青貯發(fā)酵體系中分離出乳酸菌、大腸桿菌、好氧細(xì)菌、酵母菌和霉菌，并計(jì)數(shù)；結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA序列分析鑒定分離出的乳酸菌菌株；通過(guò)研究乳酸菌的生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸特性及耐酸性，篩選優(yōu)質(zhì)乳酸菌。以期探明短芒大麥草葉圍及青貯發(fā)酵體系中微生物菌群特性及青貯料中乳酸菌多樣性，篩選出具有促發(fā)酵效果的乳酸菌菌株，為有益微生物飼料研發(fā)奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果表明，短芒大麥草經(jīng)青貯發(fā)酵后各微生物菌群數(shù)量發(fā)生不同程度變化，乳酸菌數(shù)量由0 cfu/g FM增加到4.00×108cfu/g FM，酵母菌數(shù)量由8.50×105cfu/g FM增加到1.02×108cfu/g FM，而好氧細(xì)菌、大腸桿菌和霉菌數(shù)量變化不明顯；從短芒大麥草青貯發(fā)酵體系分離得到4株乳酸菌，經(jīng)鑒定Lx36為L(zhǎng)actobacilluspentosus，Lx37為L(zhǎng)actobacillusbrevis，Lx53為Pediococcuspentosaceus，Lx54為L(zhǎng)actobacillusparabuchneri；篩選得到1株益于青貯的乳酸菌株Lx36，約在20 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，OD值達(dá)到4.21，且發(fā)酵12 h的pH僅為4.08，并可以在pH=3.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)。綜上所述，青貯發(fā)酵是體系中各種微生物相互作用的過(guò)程，微生物菌群的數(shù)量及變化直接影響青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。短芒大麥草青貯飼料中乳酸菌種類較豐富，篩選得到的戊糖乳桿菌繁殖速度快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)同時(shí)表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐酸性，具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，適宜用作促發(fā)酵的青貯添加劑菌種。

短芒大麥草；青貯；微生物特性；乳酸菌

短芒大麥草(Hordeumbrevisubulatum)產(chǎn)量高、適口性好、適應(yīng)性廣且具有較強(qiáng)的耐鹽性，其青草利用期長(zhǎng)、葉量豐富、草質(zhì)柔軟、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)好、粗蛋白含量高，是一種良好的放牧—刈割兼用型多年生禾草[1-3]。開(kāi)發(fā)短芒大麥草青貯飼料，能夠有效地利用青綠植物中的營(yíng)養(yǎng)成分、提高飼料的適口性、擴(kuò)大飼料來(lái)源、解決季節(jié)性飼草不平衡、促進(jìn)飼料的均衡供應(yīng)。

乳酸菌是影響青貯發(fā)酵品質(zhì)的主要因素之一。近年，歐美畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家及日本致力于開(kāi)發(fā)乳酸菌等添加物，改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究。而我國(guó)對(duì)于青貯乳酸菌的研究起步比較晚，對(duì)青貯乳酸菌資源的收集、發(fā)酵特性以及遺傳特性研究比較落后，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌及其制劑較少[4]，得到大量推廣應(yīng)用的更是微乎其微。本試驗(yàn)以短芒大麥草為材料，對(duì)青貯過(guò)程中起作用的微生物菌群進(jìn)行初步研究，探明該青貯料中乳酸菌多樣性，并選出性狀優(yōu)良的乳酸菌，為制備有益微生物飼料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1青貯原料

以短芒大麥草為供試材料，采自內(nèi)蒙古赤峰市林西縣良種場(chǎng)，于2013年8月短芒大麥草處于初花期，從田間按梅花形布點(diǎn)法選取5個(gè)區(qū)域取樣刈割。

1.2青貯調(diào)制

將刈割的短芒大麥草鍘成2～3 cm，充分混合均勻后，按照四分法選取適量的樣品裝入聚乙烯袋，設(shè)3次重復(fù)，每袋約200 g，用真空包裝機(jī)抽成真空并封口，室溫條件下放置60 d后開(kāi)封取樣分析。

1.3儀器設(shè)備

生物安全柜為ESCO公司的AC2-S型；恒溫培養(yǎng)箱為MEMMERT公司的INB400型；立式壓力蒸汽滅菌器為上海申安醫(yī)療器械廠的LDZX-50KBS型；臺(tái)式恒溫?fù)u床為太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠的THZ-D型；光學(xué)顯微鏡為OLMPUS的 BX51型；高速冷凍離心機(jī)為T(mén)hermo公司Fresco 21型；PCR儀為BIO-RAD的Peltier Thermal Cycler；凝膠成像儀為ALphaImage；電泳儀為北京六一儀器廠的dyy-6c型；紫外分光光度計(jì)為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司的TU-1901型。

1.4培養(yǎng)基及試劑

液體、固體MRS培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BLB培養(yǎng)基購(gòu)自日水制藥株式會(huì)社；細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、溶菌酶等購(gòu)自天根生化科技有限公司；擴(kuò)增引物購(gòu)自上海桑尼生物科技有限公司。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1微生物計(jì)數(shù) 采用稀釋平板涂布法對(duì)短芒大麥草原料和青貯料中微生物菌群進(jìn)行計(jì)數(shù)，稱取5 g待測(cè)樣品，放入裝有45 mL無(wú)菌水的三角瓶?jī)?nèi)，置于搖床振蕩30 min，將得到的溶液繼續(xù)用無(wú)菌水做10倍梯度的稀釋，分別吸取10-1，10-3和10-5三個(gè)稀釋度懸液20 μL，均勻涂于MRS、BLB、NA和PDA平板培養(yǎng)基上，MRS培養(yǎng)基上的菌落(乳酸菌)于37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，BLB、NA和PDA培養(yǎng)基上菌落(大腸桿菌、好氧細(xì)菌、酵母菌和霉菌)則直接置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后對(duì)各平板上的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)測(cè)。

1.5.2乳酸菌的分離與純化 挑取MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的典型菌落，在MRS平板上反復(fù)劃線分離，直到獲得該菌的純培養(yǎng)。對(duì)獲得的各菌株進(jìn)行革蘭氏染色[5]和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)[6]。凡是呈革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株，均認(rèn)為是疑似乳酸菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3乳酸菌的生理生化特征鑒定 乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)參照凌代文和東秀珠[6]的方法進(jìn)行。在不同溫度(10，15，40，45℃)、pH(pH=3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5，8.0)和NaCl濃度(3.0%和6.5%)條件下生長(zhǎng)試驗(yàn)以及利用API 50CH檢測(cè)乳酸菌對(duì)49種不同碳源發(fā)酵能力檢測(cè)參照Duan等[7]方法進(jìn)行。

1.5.4乳酸菌菌株的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 乳酸菌DNA的提取按照天根細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。以提取菌株的DNA為模板，應(yīng)用引物序列27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r：5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物27f和1492r(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃，變性50 s；55℃，退火50 s；72℃，延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增片段約為1500 bp，將PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序獲得的所有菌株序列信息利用Blast檢索系統(tǒng)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，選擇適當(dāng)數(shù)量與目的基因序列同源性相對(duì)較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列與測(cè)定菌株的16S rDNA序列，共同用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5.5產(chǎn)酸速率測(cè)定 將乳酸菌按3%的接種量轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)12 h，每隔2 h測(cè)定不同菌株發(fā)酵液pH，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH為縱坐標(biāo)繪制產(chǎn)酸速率曲線[8]。

1.5.6生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將乳酸菌按3%的接種量轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)36 h，每隔2 h取1次樣品,在620 nm下測(cè)定樣品的吸光度值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1短芒大麥草葉圍及青貯體系微生物計(jì)數(shù)

短芒大麥草新鮮樣品與青貯樣品中微生物種類和數(shù)量見(jiàn)表1，新鮮樣品上附著的微生物數(shù)量最多的是好氧細(xì)菌，為3.15×107cfu/g FM，其次是大腸桿菌和酵母菌，而乳酸菌和霉菌未檢測(cè)到，經(jīng)過(guò)青貯發(fā)酵后，乳酸菌數(shù)量明顯增多，達(dá)到了4.00×108cfu/g FM，酵母菌的數(shù)量也有所增加，而大腸桿菌、好氧細(xì)菌和霉菌數(shù)量幾乎沒(méi)有變化。

表1 短芒大麥草微生物計(jì)數(shù)Table 1 Microbiological analysis of the H.brevisubulatum cfu/g FM

cfu：菌落形成單位Colony forming unit；FM：鮮物質(zhì)Fresh matter.

2.2乳酸菌的生理生化特征

從短芒大麥草青貯樣品中共分離出4株乳酸菌，分別命名為L(zhǎng)x36、Lx37、Lx53、Lx54，各菌株生理生化特征見(jiàn)表2、3。 所有分離到的菌株均表現(xiàn)為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性，其中Lx36和Lx53發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)生CO2，屬同型發(fā)酵乳酸菌，而Lx37和Lx54為異型發(fā)酵乳酸菌；根據(jù)這4株乳酸菌生理生化特性可將其分成2個(gè)類群：類群Ⅰ包含Lx36、Lx37、Lx54，這3株菌均為桿菌，可在40℃、45℃、3.0% NaCl濃度和pH=4.5，5.0，7.5，8.0的環(huán)境條件下生長(zhǎng)，其中Lx36在5和10℃下不生長(zhǎng)，Lx37在5℃、6.5% NaCl濃度和pH=3.0，3.5，4.0條件下弱生長(zhǎng)，Lx54在6.5% NaCl濃度和pH=3.0條件下不生長(zhǎng)，而在pH=3.0時(shí)弱生長(zhǎng)。這3株菌均可以利用果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、密二糖和葡萄糖酸鹽，其中Lx36可以發(fā)酵苦杏仁苷、纖維二糖、甘露醇、甘露糖、海藻糖，而Lx37和Lx54不能發(fā)酵這幾種碳源，Lx54可以發(fā)酵松三糖、棉籽糖和蔗糖，而Lx37不能利用這幾種碳源，所以將3株菌株初步鑒定[6，9]屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)；類群Ⅱ包含Lx53，該菌為球菌，在5℃和pH=3.0，3.5條件下不生長(zhǎng)，可以發(fā)酵核糖、麥芽糖、海藻糖和熊果苷，不能利用松三糖、鼠李糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇和α-甲基-D-葡萄糖苷，其生理生化性狀與片球菌屬相似，初步鑒定屬于片球菌屬(Pediococcus)。

2.3乳酸菌的16S rDNA 序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序獲得的所有16S rDNA序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast相似性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表4。所有序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知16S rDNA基因序列的相似性均在99.0%～100.0%之間。

表2 青貯飼料中乳酸菌的生理生化特征Table 2 The physiological biochemical characteristics of lactic acid bacteria strains isolated from silage

+：生長(zhǎng)Positive；-：不生長(zhǎng)Negative；w：微弱生長(zhǎng)Weakly positive.

由系統(tǒng)發(fā)育分析可以看出(圖1)，4株乳酸菌分別屬于乳桿菌屬和片球菌屬，其中：Lx36與Lactobacilluspentosus的系統(tǒng)位置最接近，相似度為100.00%，Lx37與Lactobacillusbrevis處于同一進(jìn)化分支上，相似度達(dá)100.00%，Lx53與Pediococcuspentosaceus的系統(tǒng)進(jìn)化位置最接近，相似度為99.97%，Lx54與Lactobacillusparabuchneri處于同一進(jìn)化分支上，相似度達(dá)100.00%。

2.4乳酸菌生長(zhǎng)曲線及繁殖速度比較

4株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2，從曲線中可以看出4株乳酸菌均在2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其中Lx53、Lx54和Lx37約在14 h左右進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速度依次遞減，生長(zhǎng)較為緩慢，而Lx36生長(zhǎng)速度較快，明顯高于其他3株乳酸菌，約在20 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，20 h時(shí)其OD值達(dá)到4.21?？梢?jiàn)4株乳酸菌中Lx36的繁殖速度最快。

2.5乳酸菌產(chǎn)酸速率及產(chǎn)酸能力比較

4株乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸速率曲線如圖3所示。從圖中可以看出，Lx37和Lx54發(fā)酵液的pH下降較為緩慢，發(fā)酵12 h的pH分別為5.28和5.35，Lx53發(fā)酵液的pH下降較快，發(fā)酵12 h的pH為4.51，而Lx36發(fā)酵液的pH下降最快，從2 h便開(kāi)始急劇下降，其發(fā)酵12 h的pH僅為4.08?？梢?jiàn)4株乳酸菌中Lx36的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。

表3 乳酸菌API 50 CH 碳源發(fā)酵結(jié)果Table 3 API 50 CH fermentation patterns of lactic acid bacteria strains isolated from silage

+：90%菌株為陽(yáng)性90% or more of the strains are positive；-：90%菌株為陰性90% or more of the strains are negative；w：弱陽(yáng)性Weakly positive.

表4 乳酸菌株16S rDNA序列Blast比對(duì)結(jié)果Table 4 Blast results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria strains

3 討論

青貯發(fā)酵過(guò)程是各種微生物共同作用的結(jié)果，參與青貯過(guò)程的微生物包括青貯原料上附著的微生物，引起青貯飼料發(fā)酵的微生物以及引起青貯腐敗變質(zhì)的微生物等[10]，在整個(gè)青貯過(guò)程中微生物的數(shù)量存在動(dòng)態(tài)變化[11]。Kobayashi等[12]研究認(rèn)為，附生乳酸菌的數(shù)量影響最終發(fā)酵品質(zhì)，如果牧草表面附生乳酸菌數(shù)量過(guò)低，則會(huì)導(dǎo)致青貯料發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降。檢測(cè)附生乳酸菌的數(shù)量可以預(yù)測(cè)自然青貯發(fā)酵充分與否及是否有必要添加菌劑促進(jìn)發(fā)酵[13]。本研究中短芒大麥草青貯前后乳酸菌數(shù)量變化較大，青貯前并未在新鮮樣品上檢測(cè)出乳酸菌，青貯發(fā)酵后樣品中乳酸菌含量高達(dá)108cfu/g FM，酵母菌的數(shù)量由105cfu/g FM變化到108cfu/g FM，而大腸桿菌、好氧細(xì)菌和霉菌的數(shù)量變化不明顯?？梢?jiàn)短芒大麥草在青貯發(fā)酵過(guò)程中，隨著厭氧和酸性環(huán)境的形成，乳酸菌迅速繁殖，數(shù)量增加；酵母菌在厭氧條件下可利用青貯飼料中的糖分進(jìn)行繁殖，數(shù)量也有所增加；大腸桿菌和部分好氧細(xì)菌，耐酸性不強(qiáng)，當(dāng)發(fā)酵體系pH逐漸降低時(shí)，這兩類細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，但是可能由于短芒大麥草附生乳酸菌數(shù)量太低，導(dǎo)致發(fā)酵效果不理想[12]，青貯后發(fā)酵體系pH并未迅速降低到能夠顯著抑制這兩類細(xì)菌的程度，所以其數(shù)量沒(méi)有顯著降低。Zhang[14]研究了青貯原料和青貯料中微生物種類和數(shù)量，青貯前乳酸菌數(shù)量在101～107cfu/g、腸細(xì)菌數(shù)量為102～108cfu/g、酵母菌數(shù)量為101～107cfu/g、霉菌數(shù)量為102～106cfu/g，青貯后這幾類微生物數(shù)量分別為105～109cfu/g、低于102cfu/g、102～106cfu/g和104cfu/g，本研究結(jié)果基本與其相符，但短芒大麥草青貯后腸細(xì)菌和酵母菌數(shù)量較高。

圖1 基于 16S rDNA 序列分析結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 乳酸菌生長(zhǎng)曲線

圖3 乳酸菌產(chǎn)酸速率曲線

本研究對(duì)短芒大麥草青貯乳酸菌多樣性研究在國(guó)內(nèi)外尚屬首例，通過(guò)MRS培養(yǎng)基從短芒大麥草青貯發(fā)酵體系分離得到4株乳酸菌，根據(jù)表型特征、生理生化特性初步鑒定3株屬于乳桿菌屬，1株屬于片球菌屬，桿菌較球菌豐富。通常情況下乳酸桿菌對(duì)酸的耐受性要高于乳酸球菌，當(dāng)環(huán)境酸度較高時(shí)，乳酸球菌的生長(zhǎng)受到抑制，活力降低、數(shù)量減少[9]。由于分離出的4株乳酸菌碳源發(fā)酵模式與模式菌株均存在差異，因此單純利用表型相似性并不能把這些菌株鑒定到種的水平。16S rDNA序列分析既可以在種屬水平上對(duì)細(xì)菌進(jìn)行較為準(zhǔn)確的鑒定，也可以對(duì)細(xì)菌亞種進(jìn)行鑒定[15]，經(jīng)分析4株菌的16S rDNA序列與參考菌株的16S rDNA 序列相似性都在99%以上，因此Lx36鑒定為L(zhǎng)actobacilluspentosus，Lx37鑒定為L(zhǎng)actobacillusbrevis，Lx53鑒定為Pediococcuspentosaceus，Lx54鑒定為L(zhǎng)actobacillusparabuchneri。

乳酸菌是促使青貯飼料發(fā)酵的主要微生物，將其用作飼料青貯的生物添加劑，可有效地調(diào)節(jié)青貯料內(nèi)微生物區(qū)系，抑制有害菌的活動(dòng)[16-17]，調(diào)控青貯發(fā)酵過(guò)程，從而提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。因此那些繁殖速度快，產(chǎn)酸、耐酸能力強(qiáng)的乳酸菌常被篩選出來(lái)用作發(fā)酵促進(jìn)劑[18]。早期用作青貯添加劑的菌株大部分來(lái)自奶牛及乳產(chǎn)品[19]，但是結(jié)果并不理想，而從青貯飼料中分離出的乳酸菌更宜適應(yīng)青貯環(huán)境，從中篩選青貯用優(yōu)良乳酸菌則為一種高效、快速的方法。通過(guò)研究短芒大麥草青貯飼料中分離出4株乳酸菌的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)酸特性以及耐酸性，發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌Lx36為同型發(fā)酵乳酸菌，可以迅速繁殖，使酸性快速下降，并且耐酸，這些完全符合Whittenbury[20]、Wieringa和Beck[21]制定的乳酸菌劑篩選標(biāo)準(zhǔn)的一些核心觀點(diǎn)。戊糖乳桿菌廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品及醉魚(yú)中[22-25]，長(zhǎng)期的食用歷史使其被公認(rèn)為具有發(fā)酵作用的安全菌[26]，張想峰等[27]從新疆小蘆葦青貯中分離出2株戊糖乳桿菌，發(fā)現(xiàn)其中1株具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，pH最低可達(dá)3.50, 是發(fā)酵過(guò)程中的主要產(chǎn)酸菌株，本試驗(yàn)結(jié)果與此一致?？梢?jiàn)Lx36具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，適宜用作促發(fā)酵的青貯飼料發(fā)酵菌株。

4 結(jié)論

青貯發(fā)酵是體系中各種微生物相互作用的過(guò)程，微生物菌群的數(shù)量及變化直接影響青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。短芒大麥草附生乳酸菌數(shù)量極少，因此單獨(dú)青貯時(shí)最好加入適量乳酸菌劑以促進(jìn)發(fā)酵，保證發(fā)酵完全。短芒大麥草青貯飼料中乳酸菌種類較豐富，共分離出4株乳酸菌，篩選得到的戊糖乳桿菌Lx36繁殖速度快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)，同時(shí)表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐酸性，這一結(jié)果為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用作青貯促發(fā)酵劑提供了理論依據(jù)。

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Microbial characteristics ofHordeumbrevisubulatumsilage and screening for lactic acid bacteria with high fermentation performance

TAO Ya1,2, LI Feng1, GAO Feng-Qin1,2, SUN Qi-Zhong1,2*

1.GrasslandResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Huhhot010010,China; 2.KeyLaboratoryofGrasslandResourcesandUtilization,MinistryofAgriculture,Huhhot010010,China

A study has been undertaken to investigate the microbial community structure, microorganism populations and diversity of lactic acid bacteria inHordeumbrevisubulatumsilage.Lactic acid bacteria, coliform bacteria, aerobic bacteria, yeast and mold were isolated and counted by means of selective media.Lactic acid bacteria strains were identified by morphological observation, physiological and biochemical characteristics and partial 16S rDNA gene sequences.In order to assist the development of beneficial microorganisms for animal feed, the lactic acid bacteria strains with high fermentation performance were screened based on growth curves and their ability to produce and resist acid.The results showed that microorganism populations change in different ways through the fermentation process.Lactic acid bacteria populations increased from 0 to 4.00×108cfu/g FM and yeast populations grew from 8.50×105to 1.02×108cfu/g FM, whereas coliform bacteria, aerobic bacteria and mold populations did not change significantly.Four lactic acid bacteria strains were isolated fromH.brevisubulatumsilage which were identified at Lx36 isolation asLactobacilluspentosus, at Lx37 isolation asL.brevis, at Lx53 isolation asPediococcuspentosaceusand at Lx54 isolation asL.parabuchneri.Lx36 was screened out for high fermentation performance because it ceased to grow after 20 hours of cultivation, with an OD value of 4.21.The pH value of MRS broth (the bacterial growth medium) was only 4.08 after 12 hours of Lx36 cultivation, and the strain can survive in MRS broth with a pH of 3.0.These results indicate that silage fermentation is a process of microorganism interaction and that silage quality is directly influenced by the changing character of microorganism populations.Lactic acid bacteria species inH.brevisubulatumsilage were relatively abundant.L.pentosusscreened with a high ability to reproduce and to produce and resist acid, suggesting its potential value for practical applications.

Hordeumbrevisubulatum; silage; microbial characteristics; lactic acid bacteria

10.11686/cyxb2015138

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-03-11；改回日期：2015-05-20

中央公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201203042)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程牧草栽培與加工利用(CAAS-ASTIP-IGR 2015-02)資助。

陶雅(1982-)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，助研，碩士。E-mail:taoya2001@126.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:sunqz@126.com

陶雅, 李峰, 高鳳芹, 孫啟忠.短芒大麥草青貯微生物特性研究及優(yōu)良乳酸菌篩選.草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(12):66-73.

TAO Ya, LI Feng, GAO Feng-Qin, SUN Qi-Zhong.Microbial characteristics ofHordeumbrevisubulatumsilage and screening for lactic acid bacteria with high fermentation performance.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):66-73.