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    甘肅金銀花(盤葉忍冬)抗菌作用實驗研究

    2015-06-01 12:33:26高曉東李雪萍李永輝張永東李海寧
    西部中醫(yī)藥 2015年11期
    關(guān)鍵詞:埃希菌金銀花金黃色

    高曉東,李雪萍,李永輝,張永東,楊 凱,李海寧

    1甘肅省疾病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州 730000;

    2甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

    甘肅金銀花(盤葉忍冬)抗菌作用實驗研究

    高曉東1,李雪萍2△,李永輝2,張永東2,楊 凱2,李海寧2

    1甘肅省疾病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州 730000;

    2甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

    目的:觀察甘肅金銀花(盤葉忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的體內(nèi)、外抗菌作用。方法:體內(nèi)抗菌用金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠,觀測給藥小鼠在染菌后7天內(nèi)的死亡率;體外抗菌用瓊脂擴散實驗和菌落計數(shù)法測定最小抑菌濃度(M IC)和抑菌圈大小。結(jié)果:對感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌小鼠灌胃甘肅金銀花(盤葉忍冬)后小鼠的死亡率分別為45%和40%;正品金銀花為40%;兩者與模型對照組小鼠死亡率的95%相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。體外抗菌實驗測得甘肅金銀花(盤葉忍冬)和正品金銀花對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度為6.25 m g/m L和12.5 m g/m L。結(jié)論:甘肅金銀花(盤葉忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有一定的體、內(nèi)外抗菌作用。

    甘肅金銀花(盤葉忍冬);體內(nèi)外抗菌;金黃色葡萄球菌;大腸埃希菌

    盤葉忍冬(Lonicera tragophylla Hemsl.)屬忍冬科忍冬屬落葉藤本,具有清熱解毒、涼風散熱之功效。臨床上廣泛用于急性熱病及外科感染性疾病,如上呼吸道感染、急性扁桃體炎等[1-4]。本研究對甘肅金銀花(盤葉忍冬)在抗炎、解熱鎮(zhèn)痛方面進行研究,取得了一定成果,現(xiàn)報道如下:

    1 材料與方法

    1.1 藥物 甘肅金銀花(盤葉忍冬)水提濃縮物由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理實驗中心制備,藥液濃度按生藥量計算為2.63 g/mL,實驗前用滅菌蒸餾水稀釋成所需濃度。正品金銀花購自甘肅省黃河藥市,產(chǎn)地:山東,濃縮液制備同甘肅金銀花。雙黃連口服液(哈藥集團三精制藥股份有限公司生產(chǎn),批號:13051324)。

    1.2 動物 昆明種小鼠,SPF級,體質(zhì)量18~22g,雌雄兼有,由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(甘)2006-0010。

    1.3 菌株來源 金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸埃希菌(CCTCCAB200068)均由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)生物中心提供。

    1.4 試劑與儀器 BUCHI461旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士);JA-2003電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);ClassⅡ,TypeA2型生物安全柜(力康集團全資附屬公司新儀器上海有限公司);立式壓力蒸氣滅菌器(LS-B50);PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精密儀器廠)。

    1.5 方法與步驟

    1.5.1 體內(nèi)抗菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠的保護作用。選取健康小鼠140只,體質(zhì)量為18~22 g,雌雄各半,隨機分為7組,即空白對照組、模型對照組、雙黃連組、正品金銀花組,甘肅金銀花(盤葉忍冬)高劑量組(28.8g/kg)、中劑量組(14.4g/kg)、低劑量組(7.2 g/kg)。各組動物按劑量連續(xù)灌胃給藥3天(空白對照組和模型對照組給予等容量蒸餾水,金銀花對照組在感染菌前1天開始給藥),1次/d。感染前小鼠禁食過夜,第3天給藥后30分鐘,根據(jù)菌株毒力的預(yù)實驗情況選用使80%~100%小鼠死亡的金黃色葡萄球菌的干酵母懸液8.6×105cfu/mL (或大腸埃希菌6.1×106cfu/mL),0.5 mL/只,給小鼠腹腔注射造成感染(空白對照組注射等容量干酵母生理鹽水溶液)。感染后6小時再給藥1次,繼續(xù)給藥1天,觀察和記錄各組動物感染后7天內(nèi)的反應(yīng)情況以及死亡數(shù)[5-6]。

    1.5.2 體外抑菌實驗 將上述中藥各稱取20 g,加入約5倍量水,浸泡過夜后,文火煮沸30分鐘,過濾后,再加5倍量水,文火煮沸30分鐘,過濾。將2次濾液合并后在文火上濃縮至20 mL,即為100%中藥原液。調(diào)pH值為7.6。

    1.5.3 菌落計數(shù)法[7-8]將中藥原液105℃,20分鐘滅菌后即為實驗藥液。用接種環(huán)將金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24小時,傳種于無菌肉湯培養(yǎng)基中經(jīng)18小時,再傳種于無菌肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時,用前將菌液濃度1∶1000稀釋。取無菌試管270支,分3組,每管加肉湯培養(yǎng)基1 mL,第1管加所試藥液混勻后,使1~9管均含有倍比稀釋的藥液(即1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64,1∶128,1∶256,1∶512,1∶1024)。第1、2、3、4、5、6、7、8、9管每管加菌液0.05 mL,充分混勻后,37℃培養(yǎng)24小時,觀察結(jié)果。藥液對照管以第9管無細菌生長,菌液對照管第10管有細菌生長,實驗方為有效。以能抑制試驗菌生長的最高稀釋度為最低抑菌濃度MIC。

    1.5.4 瓊脂擴散法[9]每平皿加0.1mL菌液(菌液濃度為1.0×105cfu/mL),涂布整個培養(yǎng)基表面,37℃吸附30分鐘,然后上面均勻放置4個直徑約為6 mm的無菌不銹鋼牛津杯。然后用移液器在孔中加藥液200 μL;37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時后觀察并記錄抑菌圈的有無及其直徑大小(重復(fù)2次,每次做4孔,求直徑的平均值)。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行fisher確切概率法檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 體內(nèi)抗菌實驗 對感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌小鼠灌胃甘肅金銀花(盤葉忍冬)后小鼠的死亡率分別為45%和40%;正品金銀花為40%;兩者與模型對照組小鼠死亡率的95%相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    表1 甘肅金銀花(盤也忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠的保護作用(n=20)

    2.2 體外抑菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)和正品金銀花對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度為6.25 mg/mL和12.5 mg/mL。對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小分別為15 mm和19 mm;對大腸埃希菌的抑菌圈大小為16 mm和19 mm,見表2—3。

    表2 最小抑菌濃度測定結(jié)果 m g/m L

    表3 甘肅金銀花(盤葉忍冬)瓊脂擴散法抑菌實驗結(jié)果(n=8)

    3 討論

    3.1 體內(nèi)抗菌實驗 與空白對照組比較,模型對照組的小鼠死亡率為95.0%(P<0.01),表明濃度為8.6×105cfu/mL的金黃色葡萄球菌(或濃度為6.1×106cfu/mL大腸埃希菌)的干酵母懸液能引起小鼠死亡,造模成功。與模型對照組比較,雙黃連口服液組與正品金銀花組死亡率明顯降低(P<0.05);甘肅金銀花(盤葉忍冬)高、中、低各劑量組死亡率明顯降低(P<0.05)。提示甘肅金銀花(盤葉忍冬)具有對金黃色葡萄球菌或大腸埃希菌致小鼠感染死亡的保護作用,顯示了一定的體內(nèi)抗菌作用。體內(nèi)抗菌實驗主要研究藥物對感染動物的預(yù)防和保護作用,因此體內(nèi)抗菌實驗是最重要的抗菌作用的研究方法,對于研究中藥的抗微生物作用有重要意義。

    本研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的急性死亡期主要集中在48小時之內(nèi),之后存活小鼠可逐漸恢復(fù)健康。此外,通過死亡小鼠尸體解剖發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌能明顯引起小鼠小腸炎性壞死,大腸埃希菌可致小鼠肺部感染壞死。

    3.2 體外抑菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有抑制作用,對兩種菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為6.25mg/mL和12.5 mg/mL,與正品金銀花基本一致。較雙黃連口服液對兩種菌的抗菌作用弱,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與空白對照(蒸餾水)比較,其抗菌作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    [1] 申丹,唐仕歡,盧朋,等.《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準——中藥成方制劑》金銀花用藥規(guī)律分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(3):10-13.

    [2] 賀偉.金銀花的化學(xué)成分及藥理作用研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2007,4(24):8-9.

    [3] 管仲瑩,趙金明,林巧智.金銀花提取物抑菌作用的實驗研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2009,47(15):150-151.

    [4] 王天志,李永梅.金銀花的研究進展[J].華西藥學(xué)雜志,2000,15(4):292-294.

    [5] 徐淑云,卞如滾,陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:1657-1666.

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    [9] 潘清平,雷志君,周日寶,等.灰氈毛忍冬與正品金銀花抑菌作用的比較研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,22(2):243-244.

    Experimental Study on Antibacterial Effects of Gansu Honeysuckle

    GAO Xiaodong1,LI Xueping2△,LI Yonghui2,ZHANG Yongdong2,YANG Kai2,LI Haining2
    1 TCM Department of Gansu Provincial Center for Disease Control and Prevention,
    Lanzhou 730000,China;
    2 Medical Transformation Research Center of Gansu Provincial Medical and Scientific Academy

    Objective:To observe antibacterial effects of Gansu honeysuckle(Lonicera tragophylla Hemsl.)on Staphylococcus aureus(SA)and E.coli in vivo and vitro.Methods:Mortality rate of the medicated mice were detected in seven days after the mice were infected by SA and E.coli;minimal inhibitory concentration(MIC)and the size of inhibition zone were measured through agar diffusion experiments and bacterial colony counting method.Results: SA-infected and E.coli-infected mice were treated by Gansu honeysuckle and genuine honeysuckle,mortality rates of SA-infected and E.coli-infected mice treated by Gansu honeysuckle were 45%and 40%respectively;mortality rate of genuine honeysuckle was 40%;the difference was significant when both were compared with model control group with the mortality rate 95%(P<0.05).The results of antibacterial test showed that MIC of Gansu honeysuckle and genuine honeysuckle against SA and E.coli were 6.25 and 12.5 mg/mL.Conclusion:Gansu honeysuckle shows antibacterial effects to SA and E.coli in vivo and vitro to a certain degree.

    Gansu honeysuckle(Lonicera tragophylla Hemsl.);antibacterial effects in vivo and vitro;SA;E.coli

    R284.1

    A

    1004-6852(2015)11-0017-03

    2014-12-15

    高曉東(1964—),男,副主任醫(yī)師。研究方向:中藥藥理。

    △通訊作者:李雪萍(1964—),女,副主任檢驗師。研究方向:中藥藥理。

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