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    新加糖腎康對高糖環(huán)境下HK-2細胞TGF-β/Smads信號通路的影響*

    2015-06-01 12:33:32楊麗霞田廣芳張定華劉銅華
    西部中醫(yī)藥 2015年11期
    關(guān)鍵詞:腎康高糖腎小管

    程 濤,權(quán) 卓,楊麗霞,田廣芳,張定華,劉銅華

    1甘肅省中醫(yī)藥研究院,甘肅 蘭州 730050;2中國解放軍第十醫(yī)院;3甘肅省中醫(yī)院;4北京中醫(yī)藥大學

    新加糖腎康對高糖環(huán)境下HK-2細胞TGF-β/Smads信號通路的影響*

    程 濤1,權(quán) 卓2,楊麗霞1,田廣芳3,張定華3,劉銅華4

    1甘肅省中醫(yī)藥研究院,甘肅 蘭州 730050;2中國解放軍第十醫(yī)院;3甘肅省中醫(yī)院;4北京中醫(yī)藥大學

    目的:通過觀察新加糖腎康(TSK)對高糖環(huán)境培養(yǎng)下人腎小管上皮細胞(H K-2)TG F-β/Sm ads信號通路的影響,探討其防治糖尿病腎病的作用機制。方法:體外培養(yǎng)H K-2細胞,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,實驗分為6組:空白對照組、高糖組(30 m m ol/LD-葡萄糖)、空白血清對照組(30 m m ol/LD-葡萄糖+10%空白血清)、新加糖腎康低劑量組(30 m m ol/L D-葡萄糖+5%TSK藥物血清)、新加糖腎康中劑量組(30 m m ol/LD-葡萄糖+10%TSK藥物血清)、新加糖腎康高劑量組(30 m m ol/LD-葡萄糖+20%TSK藥物血清)。ELISA法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TG F-β1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β受體I(TG F-βRⅠ)、轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅱ(TG F-βRⅡ)、Sm ad2、Sm ad3的表達。結(jié)果:H K-2細胞經(jīng)高糖環(huán)境培養(yǎng)后TG F-β1、TG F-βRⅠ、TG F-β RⅡ、Sm ad2、Sm ad3的含量顯著增加,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但經(jīng)新加TSK干預后其含量下降,與高糖組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論:中藥復方TSK能夠抑制腎小管上皮細胞TG F-β/Sm ads信號通路,具有防治糖尿病腎間質(zhì)纖維化的作用。

    新加糖腎康;高糖;人腎小管上皮細胞;TG F-β/Sm ads通路

    糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一,其發(fā)病率高,危害大,在糖尿病所有并發(fā)癥中占主要地位,直接關(guān)系著糖尿病患者的生活質(zhì)量。截至目前,國內(nèi)外進行了大量DN的研究,但對其發(fā)病機制尚未完全解釋清楚。近年研究發(fā)現(xiàn),腎間質(zhì)纖維化與DN密切相關(guān)[1]。因此,通過干預腎間質(zhì)纖維化預防DN的研究逐漸興起,特別是有關(guān)中醫(yī)藥的研究越來越多。

    中藥復方新加糖腎康是在甘肅省中醫(yī)院劉國安和張定華主任醫(yī)師研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合北京中醫(yī)藥大學劉銅華教授治療DN的學術(shù)思想[2-3],經(jīng)過組方優(yōu)化,最終確立的臨床經(jīng)驗方,全方具有“益氣養(yǎng)陰,清熱祛濕,活血化瘀”的功效。前期臨床研究發(fā)現(xiàn),糖腎康對2型糖尿病患者血液流變學指標具有一定的改善作用,并能減少尿微量白蛋白,對DN患者具有較好的臨床療效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),新加糖腎康能夠減少高糖環(huán)境培養(yǎng)下人腎小管上皮細胞的細胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅲ型膠原(ColⅢ)和纖連蛋白(FN)的分泌與沉積,并能調(diào)控纖維化因子基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)及其抑制劑-1(TIMP-1)的分泌與釋放[4-5]。本課題在此研究基礎(chǔ)上,繼續(xù)觀察其對高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞TGF-β/Smads信號通路的影響,進一步揭示其治療DN的分子機制。

    1 材料與方法

    1.1 動物與細胞株 SPF級雄性Wistar大鼠20只,體質(zhì)量(200±20)g,購于甘肅中醫(yī)學院動物中心,許可證號:SCXK(甘)2011-0001,飼養(yǎng)于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動物室。人腎小管上皮細胞株(HK-2)購于上海斯信生物科技有限公司,培養(yǎng)于甘肅省中醫(yī)藥研究院中心實驗室細胞培養(yǎng)室中。

    1.2 藥品與試劑 1640培養(yǎng)基(Gibco公司,批號:1237579);胎牛血清(Gibco公司,批號:12657-029)。人TGF-β1ELISA試劑盒(批號:E9372Hu);TGF-β RⅠELISA試劑盒 (批號:E3571Hu);TGF-β RⅡELISA試劑盒(批號:E3572Hu);Smad2 ELISA試劑盒(批號:E2911Hu);Smad3 ELISA試劑盒(批號:E2912Hu),生產(chǎn)廠家均為上海晶天生物科技有限公司。D-葡萄糖(汕頭西隴化工廠有限公司,批號:0810142),用時配成30 mmol/L的濃度[6]。新加糖腎康所用中藥材購于甘肅省中醫(yī)院藥劑科,主要組成有黃芪、生地黃等藥材,用時水提醇沉,冷藏備用。

    1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(型號:MCO-18AIC,廠家:SANYO,日本);超凈生物安全柜(型號:SW-CJ-2FD,廠家:蘇凈安泰,中國);倒置顯微鏡(型號:IX51,廠家:Olympus,日本);酶標儀(型號:MS 352,廠家:Labsystems,芬蘭);-80℃超低溫冰箱(型號:MDF-U53V,廠家:SANYO,日本);立式滅菌器(型號:LMQ.CV,廠家:山東新華,中國)。

    1.4 方法

    1.4.1 新加TSK藥物血清制備方法 20只雄性Wistar大鼠隨機分為:空白組和藥物組,每組10只。藥物組采用新加TSK灌胃,劑量為成人臨床用量的6.5倍;空白組采用同體積生理鹽水灌胃。每次灌胃體積為0.01 mL/g(體質(zhì)量)。早、晚各1次,持續(xù)3天。最后1次灌胃前禁食,不禁水,在灌胃30分鐘后,大鼠股動脈無菌采血,冷凍離心吸取血清,裝入EP管中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2 H K-2細胞培養(yǎng)及實驗分組 HK-2細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。每天在顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài),及時更換新鮮培養(yǎng)基,待細胞生長融合達到80%以上,用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA的消化液消化,顯微鏡下觀察細胞消化程度,及時拍落消化的細胞,用完全培養(yǎng)基終止消化,低速離心5分鐘,用新鮮培養(yǎng)基將細胞吹打均勻后進行傳代培養(yǎng)。實驗分為6組,空白對照組:1640培養(yǎng)液培養(yǎng);高糖組:在1640培養(yǎng)液中加入30 mmol/L D-葡萄糖,對細胞進行高糖環(huán)境下培養(yǎng);空白血清對照組:在高糖組的基礎(chǔ)上,加入10%空白血清,對細胞進行干預性培養(yǎng);新加糖腎康低、中、高劑量組:在高糖組的基礎(chǔ)上,分別加入5%、10%、20%新加TSK藥物血清,對細胞進行干預性培養(yǎng)。

    1.4.3 指標檢測 采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、Smad2和Smad3的含量。

    1.4.3.1 樣本制備 將傳代培養(yǎng)的細胞吹打均勻,接種在24孔細胞培養(yǎng)板中,劑量為1 mL,每組3孔,接種2板。2小時后在顯微鏡下觀察細胞貼壁狀態(tài)。培養(yǎng)24小時后吸棄上清。每組加入1 mL含藥培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48小時,仔細吸取每孔細胞上清于1.5 mL的EP管中,4℃離心,取上清,低溫保存待測。

    1.4.3.2 指標檢測方法 按照ELISA試劑盒說明書進行。檢測前將樣本置室溫慢慢融化,在反應條孔中加入標準品或待測標本,每孔劑量為100μL。在空白對照孔加入100 μL稀釋液。在37℃培養(yǎng)箱中孵育,孵育后洗滌反應板,最后加酶標抗體進行酶聯(lián)免疫反應。反應終止后,以空白對照孔調(diào)零,在酶標儀450 nm處測定各孔OD值。

    1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,計量資料以(±s)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    各組HK-2細胞經(jīng)ELISA檢測后顯示:正常培養(yǎng)的HK-2細胞經(jīng)高糖培養(yǎng)24、48小時后,TGF-β/ Smads信號通路上的蛋白分子TGF-β1、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、Smad2和Smad3的含量顯著增加,高糖培養(yǎng)48小時時,各蛋白分子的含量更多,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);但在新加TSK干預性培養(yǎng)后,其含量開始減少,并且隨著藥物劑量的增加及作用時間的延長,藥效逐漸加強,特別是在藥物高劑量、作用48小時時,效果更為明顯,與高糖組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而空白血清對照組則無此作用。結(jié)果表明,新加TSK能夠抑制高糖環(huán)境下人腎小管上皮細胞TGF-β/Smads信號通路,在一定程度上抑制了糖尿病腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展,見表1—5。

    表1 各組H K-2細胞不同時間TG F-β1的含量比較(±s) ng/L

    表1 各組H K-2細胞不同時間TG F-β1的含量比較(±s) ng/L

    注:*表示與空白對照組相比,P<0.05;△表示與高糖組相比,P<0.05。

    組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 29.344±8.770 30.866±2.616高糖組 3 94.144±5.001*111.921±2.377*空白血清對照組 3 29.942±3.218△28.093±4.625△新加糖腎康低劑量組 3 90.502±7.529*76.041±1.876*△新加糖腎康中劑量組 3 88.056±11.137*77.564±1.876*△新加糖腎康高劑量組 3 83.652±8.781*72.671±7.195*△

    表2 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅠ的含量比較(±s) ng/L

    表2 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅠ的含量比較(±s) ng/L

    注:*表示與空白對照組相比,P<0.05;△表示與高糖組相比,P<0.05。

    組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 442.954±72.263 485.661±17.491高糖組 3 848.671±101.098*1070.881±21.592*空白血清對照組 3 436.948±70.066△404.918±50.526△新加糖腎康低劑量組 3 755.916±58.342*707.204±50.048*△新加糖腎康中劑量組 3 683.848±79.506*695.192±46.174*△新加糖腎康高劑量組 3 609.111±69.722△497.005±86.268△

    表3 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅡ的含量比較(±s) ng/L

    表3 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅡ的含量比較(±s) ng/L

    注:*表示與空白對照組相比,P<0.05;△表示與高糖組相比,P<0.05。

    組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 402.842±49.284 367.093±28.694高糖組 3 712.308±25.727*845.698±61.127*空白血清對照組 3 344.684±46.457△370.828±70.212△新加糖腎康低劑量組 3 625.870±19.297*558.642±31.786*△新加糖腎康中劑量組 3 620.535±95.894*546.370±51.181*△新加糖腎康高劑量組 3 480.208±25.926△417.248±52.188*△

    表4 各組H K-2細胞不同時間Sm ad2的含量比較(±s) ng/L

    表4 各組H K-2細胞不同時間Sm ad2的含量比較(±s) ng/L

    注:*表示與空白對照組相比,P<0.05;△表示與高糖組相比,P<0.05。

    組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 273.212±17.254 370.347±49.673高糖組 3 657.410±13.259*841.368±56.214*空白血清對照組 3 332.361±65.145△344.300±49.163△新加糖腎康低劑量組 3 619.424±50.151*586.322±52.860*△新加糖腎康中劑量組 3 554.306±60.014*558.647±75.666*△新加糖腎康高劑量組 3 458.256±27.192*△373.603±46.589△

    表5 各組H K-2細胞不同時間Sm ad3的含量比較(±s) ng/L

    表5 各組H K-2細胞不同時間Sm ad3的含量比較(±s) ng/L

    注:*表示與空白對照組相比,P<0.05;△表示與高糖組相比,P<0.05。

    組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 277.418±19.498 350.608±39.562高糖組 3 692.518±57.764*837.829±35.706*空白血清對照組 3 371.443±55.527△316.417±92.657△新加糖腎康低劑量組 3 564.836±86.995*570.712±74.538*△新加糖腎康中劑量組 3 534.919±46.955*517.823±23.610*△新加糖腎康高劑量組 3 425.401±29.085△406.169±30.296△

    3 討論

    近年研究認為,糖尿病腎病(DN)的形成與發(fā)展與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是所有腎臟疾病發(fā)展進行到終末期的共同病理改變的基礎(chǔ)。其形成與多種病理因素相關(guān),最為常見的有高血壓、高血糖、蛋白尿、氧化應激及各類纖維化因子等。這些病理因素通過特定的信號通路引起腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化,致使上皮細胞的形態(tài)發(fā)生改變,成為另一種新的細胞。腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化后,主要變?yōu)榧〕衫w維細胞,這是細胞外基質(zhì)成分的主要來源,也是纖維化形成的主要特征[7]。因此,干預腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化、抑制腎間質(zhì)纖維化成為防治DN的主要途徑。

    腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程中起關(guān)鍵作用的是TGF-β,已被公認為纖維化最主要的誘導因子,且其他細胞因子均通過調(diào)節(jié)TGF-β的表達來發(fā)揮作用。Yang等[8]研究報道,在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型中,TGF-β1參與了纖維化的發(fā)展過程,誘導了腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。Fan等[9]報道,在鼠腎小管上皮轉(zhuǎn)分化中,纖維化程度隨著TGF-β劑量的增加而增強。TGF-β誘導纖維化的作用主要通過Smads信號通路來實現(xiàn)[10],止消通脈寧和糖耐康干預糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化也證實了這一觀點[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn),在高糖環(huán)境下人腎小管上皮細胞TGF-β1的含量顯著增加,其受體TGF-β RI、TGF-β RII的含量以及下游信號分子Smad2、Smad3的含量均顯著增強,與既往報道基本一致,說明Smads信號通路激活是糖尿病腎間質(zhì)纖維化的機制之一。因此,抑制TGF-β/Smads信號通路是干預腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵。

    目前關(guān)于腎間質(zhì)纖維化的治療缺乏有效措施,許多研究仍處在初級階段,西醫(yī)研究主要集中在TGF-β中和抗體或天然拮抗劑及基因治療等方面,這些研究成本高,期限長,缺乏臨床實踐基礎(chǔ),藥物應用前景難以預測。近年來,中醫(yī)藥在該方面的研究越來越多,從化濁排毒、清熱利濕、活血化瘀等多個角度開展了很多抗纖維化的基礎(chǔ)研究及臨床研究,涉及臨床觀察、動物實驗、細胞實驗,并取得了較好的研究效果[13]。

    DN屬中醫(yī)“消渴”兼“腎病”范疇。古代醫(yī)家認為:消渴日久,臟腑氣血虛衰,水濕痰濁內(nèi)停,瘀血阻絡(luò),發(fā)為水腫尿甜?;静C特點為“本虛標實”。本課題所選中藥復方新加糖腎康,由生黃芪、地黃等中藥組成,方中黃芪、生地黃益氣養(yǎng)陰,為君藥;槐米、大黃清熱祛濕,為臣藥;益母草、山楂、水蛭活血化瘀,為佐藥。其中水蛭為新增蟲類藥,加強了組方的活血化瘀作用。全方具有“益氣養(yǎng)陰,清熱祛濕,活血化瘀”的功效,符合DN“本虛標實”的理論基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn),新加糖腎康能夠抑制高糖環(huán)境培養(yǎng)下人腎小管上皮細胞TGF-β1超表達,進而抑制了TGF-β RI、TGF-β RII的表達,繼而抑制了其信號通路分子Smad2、Smad3的表達,最終抑制了腎間質(zhì)纖維化的信號轉(zhuǎn)導,阻止了纖維化的發(fā)展,這可能是其防治糖尿病腎間質(zhì)纖維化的分子機制之一。

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    Influence of XinJia TangShenKang on TGF-β/Smads Signal Channel of HK-2 Cells in High Concentrations of Glucose

    CHENG Tao1,QUAN Zhuo2,YANG Lixia1,TIAN Guangfang3,ZHANG Dinghua3,LIU Tonghua4
    1 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
    2 The Tenth Hospital of Chinese PLA;
    3 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine;4 Beijing University of Chinese Medicine

    Objective:To explore the mechanism of XinJia TangShenKang (TSK)in treating diabetic nephropathy by observing its effects on TGF-β/Smads signal channel of human renal tubular epithelial cells HK-2 in high concentrations of glucose.Methods:HK-2 cells were cultivated in 1640 culture media containing 10%fetal bovine serum,they were randomized into six groups:blank control group,high glucose group (30 mmol/L D-glucose),the control group of blank serum (30 mmol/L D-glucose+10%blank serum),low dose (30 mmol/L D-glucose+5%TSK medicated serum),moderate dose(30 mmol/L D-glucose+10%TSK medicated serum)and high dose(30 mmol/L D-glucose+20%TSK medicated serum)groups of TSK.ELISA method was used to detect the expressions of TGF-β1,TGF-β RⅠ,TGF-β RⅡ,Smad2 and Smad3.Results:The contents of TGF-β1,TGF-β RⅠ, TGF-β RⅡ,Smad2 and Smad3 increased significantly after HK-2 cells cultivated in high concentrations of glucose, it had significant difference compared with blank control group(P<0.05).The contents of these indexes decreased after intervened with XinJia TSK,and it had significant difference compared with high glucose group(P<0.05). Conclusion:The compound TSK could inhibit TGF-β/Smads signal channel of HK-2,it could prevent and treat diabetic renal interstitial fibrosis.

    XinJia TangShenKang;highglucose;humanrenaltubularepithelialcells;TGF-β/Smadssignalchannel

    R587.1

    A

    1004-6852(2015)11-0013-04

    2015-05-07

    甘肅省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學技術(shù)研究課題(編號G ZK-2011-13)。

    程濤(1971—),男,副主任醫(yī)師。研究方向:中醫(yī)內(nèi)科學。

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