兔動(dòng)脈粥樣硬化改良模型的建立及其評(píng)價(jià)

劉洋，何春水

兔動(dòng)脈粥樣硬化改良模型的建立及其評(píng)價(jià)

劉洋，何春水

（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科，四川成都610072）

目的：通過(guò)球囊擴(kuò)張兔左頸總動(dòng)脈探討兔動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及其評(píng)價(jià)。方法：48只家兔隨機(jī)分為四組：普通飼料喂養(yǎng)組(12只)：普通飼料每天50 g／Kg，飼養(yǎng)10周；高脂組(12只)：普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，高脂飼料每天50 g／Kg喂養(yǎng)8周后處死；傳統(tǒng)斑塊模型組(12只)：普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，在直視下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，行球囊損傷術(shù)，然后結(jié)扎左頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，術(shù)后再喂養(yǎng)8周后處死；改良斑塊模型組(12只)：普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，在直視下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，行球囊損傷術(shù)，然后用7-0絲線縫合破口，術(shù)后再喂養(yǎng)8周后處死，觀察實(shí)驗(yàn)前后血脂、頸動(dòng)脈直徑及其管壁形態(tài)變化。結(jié)果：與普通組相比，后三組均形成了高脂血癥。改良組造影提示造模成功。改良組內(nèi)膜厚度相對(duì)于傳統(tǒng)組明顯增厚，而中膜厚度明顯變薄。結(jié)論：相對(duì)于傳統(tǒng)造模方法，改良法沒(méi)有破壞術(shù)側(cè)的血流狀態(tài)，能形成更為明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。

動(dòng)脈粥樣硬化；兔；模型；球囊損傷

作為發(fā)病率高、嚴(yán)重影響人類健康的疾病，動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)，也是導(dǎo)致心梗、腦梗、壞疽和肢體功能喪失的主要原因[1]。但AS的發(fā)病機(jī)制目前并不清楚，探討其發(fā)病機(jī)制及治療措施的關(guān)鍵系建立合適的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。自從1908年Ignatowski成功地制作了第一例AS家兔動(dòng)物模型以后，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者相繼改進(jìn)并進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，然其結(jié)果均不甚理想。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，改進(jìn)了傳統(tǒng)模型的造模方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性日本大耳白兔48只，月齡3～4月，體重2.5～3.5 Kg。由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生產(chǎn)供應(yīng)部提供。合格證：SCXK川2004-14。動(dòng)物級(jí)別：一級(jí)。

1.2 材料與設(shè)備

市購(gòu)二甲苯、甲醛、95%乙醇、HE染料、石蠟等，北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供的α-SMA多克隆抗體，4%多聚甲醛，膽固醇，Guerbet公司提供碘比醇。

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括：全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、病理組織漂烘儀、手術(shù)放大鏡、球囊導(dǎo)管、自動(dòng)生化檢測(cè)儀等。

1.3 建模及分組

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組

分成4組：①普通飼料喂養(yǎng)組：12只，普通飼料每天50 g／Kg，飼養(yǎng)10周；②高脂飼料對(duì)照組：12只，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，高脂飼料每天50 g／Kg喂養(yǎng)8周后處死。高脂飼料含有1%膽固醇、8%豬油和91%普通飼料；③傳統(tǒng)斑塊模型組：12只，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，在直視下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，行球囊損傷術(shù)，然后結(jié)扎左頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端，術(shù)后再喂養(yǎng)8周后處死；④改良斑塊模型組：12只，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，在直視下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，行球囊損傷術(shù)，然后用7-0絲線縫合破口，術(shù)后再喂養(yǎng)8周后處死。

1.3.2 改良組操作方法

經(jīng)耳緣靜脈注射苯巴比妥鈉（30 mg/Kg）麻醉后依次消毒，沿頸前正中線，縱行剖開(kāi)皮膚4～5 cm，依次分離皮下組織，游離左頸總動(dòng)脈4～5 cm，用動(dòng)脈夾阻斷遠(yuǎn)近端血流，在其近心端用眼科剪做0.5 cm橫切口，逆行插入4F動(dòng)脈鞘管，然后插入球囊導(dǎo)管(2.5 mm×20 mm)距切口約4 cm處，將球囊連接手動(dòng)壓力泵，注入（50%碘比醇+50%生理鹽水）使球囊內(nèi)壓力達(dá)到10個(gè)大氣壓，維持此壓力緩慢回拉球囊損傷頸總動(dòng)脈內(nèi)膜，損傷長(zhǎng)度為3 cm；上述過(guò)程共3次。退出球囊導(dǎo)管和鞘管，繼而用7-0的絲線間斷縫合破口，松開(kāi)動(dòng)脈夾，恢復(fù)血供，檢查吻合口無(wú)狹窄，頸總動(dòng)脈充盈好、搏動(dòng)好后，局部沖洗慶大霉素、連續(xù)縫合皮膚。術(shù)前靜脈注射肝素0.1 IU/Kg抗凝。術(shù)后肌肉注射慶大霉素8 000單位預(yù)防感染及靜脈注射肝素0.1 IU/Kg抗凝，連續(xù)3 d。

1.4 觀察指標(biāo)的檢測(cè)

第1周及第10周時(shí)采集兔耳正中動(dòng)脈血液，檢測(cè)甘油三脂(TG)、膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。4組動(dòng)物均于喂養(yǎng)10周后參考術(shù)前造模步驟，用8 mL碘比醇造影觀察造模血管粥樣斑塊情況，并計(jì)算出動(dòng)脈內(nèi)徑大小(以血管最狹窄處為標(biāo)記)；處死取材，剪取靶血管段，放入4%多聚甲醛液中固定24 h以上，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，每份標(biāo)本用石臘包埋，間斷均勻切片（厚度5μm），行HE染色及免疫組化檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以x±s表示，四組樣本之間的對(duì)比采用單因素等方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中傳統(tǒng)斑塊組死亡1只，改良斑塊組死亡1只，傳統(tǒng)組一例術(shù)側(cè)血管形成血栓，共46只用于結(jié)果分析。

2.1 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血脂及頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)對(duì)比（表1～表2，圖1）

2.1.1 組內(nèi)對(duì)比

4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)前后膽固醇濃度、甘油三酯濃度、低密度脂蛋白濃度均明顯增高（P＜0.05）；傳統(tǒng)組及改良組實(shí)驗(yàn)前后頸動(dòng)脈狹窄處直徑有明顯變化（P＜0.05），而普通組和高脂組變化不大（P＜0.05）。

2.1.2 組間對(duì)比

與正常組相比，其余三組血清血脂水平升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造影結(jié)果提示改良組術(shù)前與術(shù)后有顯著差異，改良組與傳統(tǒng)手術(shù)組、高脂組術(shù)后均存在顯著差異；改良手術(shù)組泡沫細(xì)胞陽(yáng)性面積比率和傳統(tǒng)組、高脂組、正常組均有顯著差異（P＜0.05）。

表1 實(shí)驗(yàn)前后血清血脂水平及其變化

表2 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸動(dòng)脈形態(tài)參數(shù)對(duì)比

圖1 喂養(yǎng)10周后血管造影

2.2 頸總動(dòng)脈形態(tài)變化的鏡下特點(diǎn)

四組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間頸總動(dòng)脈鏡下形態(tài)變化各不相同，其具體改變見(jiàn)圖2。

圖2 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸總動(dòng)脈形態(tài)特征（HE染色×400）

2.3 a-SMA在動(dòng)脈壁的表達(dá)

相對(duì)于正常組和高脂組，傳統(tǒng)組與改良組內(nèi)膜的陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，后二者之間又以改良組陽(yáng)性表達(dá)更為顯著（圖3）。

圖3 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物a-SMA在動(dòng)脈壁的表達(dá)（HE染色400×）

3 討論

早在1908年，Ignatowski為發(fā)展AS的實(shí)驗(yàn)性研究，便使用含膽固醇的飼料喂養(yǎng)家兔，制作了AS的動(dòng)物模型。此后，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者從AS的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，相繼建立了不同動(dòng)物的模型，其造模的動(dòng)物有：大白兔、雞、鼠、豬和猴等[2-5]。

目前制作AS模型的方法主要包括：脂質(zhì)浸潤(rùn)、鈣超載、免疫刺激及內(nèi)膜損傷等[6-8]。AS的發(fā)病機(jī)制傾向于“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為AS各種危險(xiǎn)因素最終作用點(diǎn)，都在于啟動(dòng)或加重動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。AS病變的形成是在動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后，炎癥-纖維增生性反應(yīng)綜合所致。故而，有研究者主張，從動(dòng)脈內(nèi)膜損傷角度出發(fā)，建立AS模型，其中最多見(jiàn)的方法系直接機(jī)械損傷內(nèi)膜。

LeVeen等[9]觀察到，球囊導(dǎo)管自股動(dòng)脈插入髂動(dòng)脈，以生理鹽水充盈球囊，向外反復(fù)多次抽拉，繼而再高膽固醇喂食8周后，家兔可出現(xiàn)明顯AS表現(xiàn)。這一方法也是廣大國(guó)內(nèi)外學(xué)者所接受的主要手段，并廣泛用于頸總和胸腹主動(dòng)脈的造模[10]。另外Fishman等[11]和張磊等[12]則發(fā)明并改進(jìn)了血管空氣干燥術(shù)建模方法。這一方法系分離頸動(dòng)脈后以動(dòng)脈夾阻斷血流，使用頭皮針平行穿刺，沖洗出血液后接上氣流將內(nèi)膜干燥化處理，然后注入生理鹽水，放開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)血流，這一模型數(shù)周高脂飲食后可出現(xiàn)明顯AS表現(xiàn)。球囊法造成內(nèi)皮細(xì)胞的即刻剝脫，而空氣法并不會(huì)導(dǎo)致內(nèi)膜剝脫，但二者均是比較成熟的造模方法。

自從1980年Block等報(bào)道[13]了血管成形術(shù)后家兔動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的變化，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)就成為復(fù)制AS再狹窄模型的經(jīng)典方法。這種方法的核心思想為球囊在動(dòng)物頸動(dòng)脈插入內(nèi)使用607.95～1013.25 kPa反復(fù)充盈，加上多次回拉撕裂甚至剝脫內(nèi)膜以暴露基底膜，引發(fā)一系列的病理改變[14-15]。加上后續(xù)的高脂飲食便可復(fù)制動(dòng)物模型。但是傳統(tǒng)的方法結(jié)扎遠(yuǎn)端的血管，形成了血管遠(yuǎn)端的死腔，破壞了其血流動(dòng)力學(xué)，基于此，我們?cè)谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)中將這個(gè)方法進(jìn)行了改良：用7-0縫線間斷縫合切口，以維持兔頸總動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)的原始狀態(tài)。血管造影測(cè)定出改良組血管狹窄程度更為明顯，HE染色能明顯觀察到相對(duì)于傳統(tǒng)組的纖維斑塊期，改良組是處于更為成熟的粥樣斑塊期，圖像分析儀測(cè)定的內(nèi)膜增厚，中膜萎縮，泡沫細(xì)胞增多，改良組與傳統(tǒng)組相比均更為明顯，說(shuō)明改良手術(shù)組所形成的AS模型更為典型。

在該改良法制作的模型中，我們通過(guò)血管縫合技術(shù)，將手術(shù)段的血管加以縫合，保證了球囊損傷頸動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，通過(guò)血管造影、病理學(xué)組織切片以及免疫組化檢測(cè)，均能驗(yàn)證該模型獲得的頸動(dòng)脈標(biāo)本具有顯著的動(dòng)脈粥樣硬化變化，與傳統(tǒng)模型組相比，觀察血流變化更準(zhǔn)確，在此模型的基礎(chǔ)上還能更進(jìn)一步的研究血流動(dòng)力學(xué)的改變對(duì)AS的影響因素，更精確得深入觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

在前人研究基礎(chǔ)上，我們使用血管縫合技術(shù)將手術(shù)段的血管加以縫合，則大大降低了傳統(tǒng)模型中血流動(dòng)力學(xué)的改變對(duì)AS的影響，與傳統(tǒng)造模組相比，模型方式更符合生理模式。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立的實(shí)驗(yàn)中，高脂飼養(yǎng)中死亡1只，球囊損傷手術(shù)操作中未發(fā)生死亡，總的存活率在85%以上。球囊損傷與血管吻合操作時(shí)間在30 min左右，實(shí)驗(yàn)新西蘭兔從麻醉到完全蘇醒在60 min內(nèi)，與傳統(tǒng)造模組相比，手術(shù)造模時(shí)間延長(zhǎng)不多，實(shí)驗(yàn)兔死亡率相仿。故實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)，新西蘭兔的手術(shù)屈從性佳，方便可行。

本實(shí)驗(yàn)建立的動(dòng)脈粥樣硬化模型達(dá)到了以下要求：①狹窄血管局部的病理改變達(dá)到成熟的纖維斑塊期，與人類典型的粥樣硬化病變已很接近；②病變血管明顯狹窄，以內(nèi)膜增厚為主；③能用臨床最常用、最可靠的方法——?jiǎng)用}血管造影來(lái)檢測(cè)和評(píng)價(jià)狹窄程度、部位和范圍；④模型建立的周期較短，僅兩個(gè)月；⑤選取家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其解剖結(jié)構(gòu)與人接近，動(dòng)物大小和血管口徑具有較好的可操作性，而且動(dòng)物來(lái)源充足，動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)和飼養(yǎng)費(fèi)用相對(duì)低廉。因此，該方法建立的AS動(dòng)物模型，適合在實(shí)驗(yàn)研究中推廣應(yīng)用。

1.Nasledova ID，Loskutova EA.Effect of hormones on the state of the thyroid gland in experimentalatherosclerosis[J]. Vrach Delo，1966，12:7-25.

2.Russian Khomulo PS，Zharova IP.Role of endocrine mechanisms in the development of atherosclerosis[J].Biull Eksp Biol Med，1972，73(7):17-20.

3.Flecknstein KN，Kehel L，Bouayadi FE，et al.New model of atherosclerosis in insulin resistant sand rats:hypercholesterolernia combined with D2 vitamin[J].Atherosclerosis，2000，150:55-61.

4.Wilgram GF.Dietary method for induction of atherosclerosis，coronary occlusion and myocardial infarcts in rats[J]. Proc Soc Exp Biol Med，1958，99:496.

5.Jellinek H，Harsing J，F(xiàn)uzcesi SZ.A new model for atherosclerosis，an electron microscopy study of the lesion induced by i.v.administered fat[J].Atherosclerosis，1982，43:7-18.

6.Van Ryn J，Lorenz M，Merk H，et al.Accumulation of radiolabelled platelets and fibrin on the carotid artery of rabbitsafterangioplasty：efectsofheparin and dipyridamole[J]. Thromb Haemost，2003，90(6)：79-86.

7.Lshibahshi T，Obayashi S，Sakamoto S，et al.Estrogen replacement effectively improves the accelerated intimal hyperplasia following balloon injury of carotid artery in the ovarieetomized rats[J].J Cardiovasc Pharm acol，2006，47 (1)：37-45.

8.Li M，Zhang Y，Ren H，et al.Effect of clopidogrel on the inflammatory progression of early atherosclerosis in rabbits model[J].Atherosclerosis，2007，194(2):48-56.

9.Corti R，Osende J，Hutter R，et al.Fenofibrate induces plaque regression in hypercholesterolemic atherosclerotic rabbits:in vivo demonstration by high-resolution MRI[J]. Atherosclerosis，2007，190(1):106-113.

10.Louis H，Lacolley P，Kakou A，et al.Early activation of internal medialsmooth muscle cells in the rabbit aorta after mechanical injury:relationship with intimal thickening and pharmacological applications[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33(1～2):131-148.

11.Fishman JA，Graeme BR，Morris JK，et al.Enfothelial regmeration in the rat carotid artery and the significance of endothelial demudation in the pathogenesis of myointimal thickening[J].Lab Invest，1975，32:339-351.

12.張磊，陳國(guó)榮，鄭榮遠(yuǎn)，等.高脂飼料加空氣干燥術(shù)建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2002，9 (2)：155-158.

13.Joseph BM.Chlamydia pneumoniae-induced atherosclerosis in arabbit model[J].J Infect Dis，2000，181(3):s505-507.

14.Lin TM，Jiang MJ，Eng HL，et al.Experimental infection with bovine herpesvinus-4 enhances atherosclerotic process in rabbits[J].Lab Invest，2000，80(1):3-11.

15.Kleindienst R，Schett G，Amberger A，et al.Atherosclerosis as an autoimmune condition[J].Isr J Med Sci，1995，31(10):596-599.

（2015-03-23收稿）

Establishment and evaluation of a modified athesclerotic plaque model in rabbits

Liu Yang，He Chunshui
Departmentof Vascular Surgery，the Affiliated Hospitalof Chengdu University of T.C.M

Objective：To establish and evaluate a modified athesclerotic plaque model in rabbits.Methods: Forty eight rabbits were randomly divided into four groups:Normal food group(No.12):feeding with normal food 50 g/Kg for 10 weeks；High-fat group(No.12):after 2 weeks of ordinary food for adaptatian，high-fat food 50 g/ Kg for 8 weeks，then sacrificed.Traditional plague group(No.12)：after ordinary food for adaptation 2 weeks，under direct vision，the left common carotid artery，was isolated，balloon injury and ligation were performed，after operation，feeding for 8 weeks then sacrified.Modified plaque model group（No.12）:ordinary feeding 2 weeks，under the directvision isolated the left common carotid artery，performed balloon injury，and then using 7-0 silk thread to suture the crevasse.feeding 8 weeks then sacrificed Blood lipid，the carotid artery diameter and morphological change were observed before and after the experiment.Results：Compared with normal food group，hyperlipidemia were formed in the rest three groups.Angiography confrmed the success of the establisment of the modified model.Thickness of the intima was more obvious in improved group than in the traditional group，and the film thickness of tunica media was obviously thinner.Conclusion：Compared with traditional building method，the improved method can form more obvious atherosclerotic plaque without damage to blood flow.

Atherosclerosis;Rabbit;Models;Balloon injury

R543.5

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.04.023

劉洋（1979-），男，主治醫(yī)師，碩士，E-mail：zjobliu@163.com