18β-甘草次酸長期灌胃對大鼠肝功能及肝臟組織形態(tài)的影響 *

桂 巖，張小兵，江 英，王有虎，張福宏，劉翔毅，馬 毅，董 明，楊貴軍

(1.蘭州大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

18β-甘草次酸長期灌胃對大鼠肝功能及肝臟組織形態(tài)的影響*

桂 巖1，張小兵1，江 英1，王有虎1，張福宏1，劉翔毅2，馬 毅1，董 明1，楊貴軍1

(1.蘭州大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

目的：觀察18β-甘草次酸長期灌胃對正常大鼠肝臟功能及組織形態(tài)的影響。方法：將120只大鼠(雌雄各半)隨機分成正常對照組和甘草次酸低劑量(25μg/g )、中劑量(50 μg/g)、高劑量組(100μg/g) 4組。每組分別以相應劑量甘草次酸灌胃，于給藥6周、14周、22周、30周及停藥4周檢測大鼠丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬甘酸氨基轉移酶(AST)、清蛋白、球蛋白、總蛋白、膽紅素及堿性磷酸酶等指標，以及肝臟臟器指數(shù)和組織形態(tài)學改變。結果：干預6周、14周、22周、30周及停藥4周,甘草次酸低、中、高劑量組與正常對照組轉氨酶、清蛋白、膽紅素及堿性磷酸酶對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而球蛋白和總蛋白在給藥30周及停藥4周時均低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但3個劑量組之間對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在各觀測時間點，各組間大鼠肝臟組織形態(tài)未見明顯改變,肝小葉結構完整、肝索排列整齊、肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。結論：不同劑量甘草次酸長期灌胃對大鼠肝功能及肝臟組織形態(tài)無顯著影響，但長期用藥可因其免疫抑制作用而致球蛋白降低。

18β-甘草次酸；肝功能；肝臟組織形態(tài)；動物；大鼠

甘草屬豆科植物,性平味甘，有祛痰止咳、補脾益氣、清熱解毒、調和諸藥之功效，可與金銀花、連翹等配伍用于癰疽瘡瘍、咽喉腫痛；與白術、黨參等配伍成理中丸，用于脾氣虛；與黃精、白芷等配伍成黃白甘草湯，用于脾虛血燥型剝脫性唇炎[1]；與芍藥等配伍，用于風熱型過敏性紫癜等[2]；與黃芪、黨參及白術等藥物配伍制成加味玉屏風散，用于脾肺虛寒型變應性鼻炎等[3]。此外，甘草還具有調和之效，能緩解大黃、芒硝等烈性藥對胃腸道的強烈刺激。甘草的有效成分甘草酸在體內水解掉2分子葡萄糖醛酸后形成甘草次酸[4]。甘草次酸有良好的生理活性、生物相容性和較低的不良反應，具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗?jié)?、抗氧化、降血脂、?zhèn)咳、改善胰島素抵抗以及免疫調節(jié)等多種藥理作用[5-9]。隨著臨床推廣和研究深入，甘草次酸的不良反應也得到重視。這方面的報道多見于長期或大量服用甘草酸制劑產(chǎn)生的腎上腺鹽皮質樣副作用如水鈉潴留、高血壓等，而長期大劑量甘草次酸灌胃對正常大鼠肝功能以及對肝臟組織形態(tài)的影響尚未見報道。本研究通過不同劑量甘草次酸長期灌胃，觀察其對大鼠肝臟形態(tài)及功能的影響，為甘草次酸的安全劑量及用藥周期提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康Wistar大鼠120只，體質量180～220 g,由甘肅中醫(yī)學院SPF動物中心提供,動物質量編號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 試劑與儀器

18β-甘草次酸，500 g/袋，AR級，甘肅泛植生物科技有限公司產(chǎn)品，批號12081603。OLYMPUS AU2700全自動生化分析儀，產(chǎn)地日本。

1.3 動物分組

將大鼠隨機分為正常對照組、甘草次酸低劑量組(25 μg/g)、中劑量組(50 μg/g)和高劑量組(100 μg/g)4組，每組30只。

1.4 給藥干預

按照動物體表面積轉換計算公式[10]計算給藥量。本實驗中,大鼠體質量在180～220 g，按平均值200 g計算。甘草次酸組參照復方甘草酸苷片臨床用量(每片含甘草酸25 mg，3片/次，3次/日，每日甘草酸總用量225 mg)。低、中、高劑量組每日給藥劑量分別為25，50，100 μg/g ，混于2 mL生理鹽水灌胃；正常對照組以等量生理鹽水替代。

1.5 檢測指標

分別于給藥6周、14周、22周、30周及停藥4周，每組隨機取6只大鼠，100 g/L 水合氯醛(3 μL/g)腹腔注射麻醉，剪毛、打開胸腔；心臟采血后立即以40 g/L多聚甲醛50 mL快速心臟灌注；隨即打開腹腔， 取出肝臟，稱量質量并計算臟器指數(shù)；以100 g/L 甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片行HE染色；光鏡下觀察組織的病理形態(tài)學變化。

采用蘭州大學第一醫(yī)院檢驗科OLYMPUS AU2700全自動生化分析儀檢測不同時間點各組大鼠血清天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、清蛋白、球蛋白、總蛋白、總膽紅素及堿性磷酸酶等肝功能相關指標的變化。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠AST、ALT含量對比

2.1.1 血清AST

給藥6周時,甘草次酸低、中、高劑量組AST含量與正常對照組對比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，3個劑量組之間的差別亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此后，隨著干預時間的延長，在14周、22周、30周時間點，甘草次酸低、中、高劑量組AST含量有升高趨勢，但較正常對照組仍無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。停藥4周，3個劑量組AST含量較同組30周時有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義，各組間差別亦無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組大鼠血清AST含量對比

表1 各組大鼠血清AST含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組6128．50±27．25143．5±25．88145．75±48．09137．25±46．59136．50±32．13甘草次酸低劑量組6133．75±29．66152．25±41．79159．00±33．11162．50±28．84144．50±25．45甘草次酸中劑量組6126．5±29．89155．25±31．43155．16±28．85172．0±41．56140．71±16．34甘草次酸高劑量組6135．25±31．62172．25±32．62172．50±50．92189．50±113．8144．35±28．58

2.1.2 血清ALT

在各時間點，甘草次酸低、中、高劑量組血清ALT含量組間對比，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；甘草次酸3個劑量組分別與相應時間點的正常對照組對比，差別亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清ALT含量對比

表2 各組大鼠血清ALT含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組646．17±12．3450．50±16．4353．5±15．7850．25±18．82 47．0±17．19甘草次酸低劑量組641．0±14．7852．0±24．5958．17±29．5751．50±37．5045．50±10．03甘草次酸中劑量組643．33±10．8651．33±14．9856．67±14．6758．50±21．9255．43±7．09甘草次酸高劑量組644．20±16．2754．17±20．4559．33±17．5259．0±13．0257．83±14．91

2.2 各組大鼠血清蛋白含量對比

2.2.1 血清總蛋白

在6周、14周、22周各時間點，甘草次酸低、中、高劑量組組間血清總蛋白含量對比，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥30周，甘草次酸3個劑量組血清總蛋白均低于正常對照組(P<0.05)。停藥4周后，3個劑量組總蛋白有所回升、但仍低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3個劑量組之間對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清總蛋白含量對比

表3 各組大鼠血清總蛋白含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組671．90±5．6473．73±4．2470．93±4．7771．2±6．4172．8±2．24甘草次酸低劑量組670．40±3．7770．55±2．4568．24±4．2060．20±3．83?64．65±5．06?甘草次酸中劑量組670．85±1．3871．42±4．1270．02±6．8663．05±4．25?65．70±5．16?甘草次酸高劑量組669．58±3．4170．45±3．7870．11±4．8462．27±2．67?62．57±2．96?

注：與正常對照組對比，*P<0.05。

2.2.2 血清清蛋白

在各個觀測時間點，各組間血清清蛋白含量對比，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清清蛋白含量對比

表4 各組大鼠血清清蛋白含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組635．78±5．9837．60±3．1436．27±2．7835．70±5．2436．40±1．12甘草次酸低劑量組635．33±2．7636．47±1．5935．98±3．6434．28±1．8434．77±0．96甘草次酸中劑量組634．13±1．3036．85±1．3536．55±3．0934．98±2．0135．76±2．74甘草次酸高劑量組635．18±1．6236．37±0．8437．32±1．3534．68±1．4434．52±0．43

2.2.3 血清球蛋白

在給藥6周、14周及22周，各組間血清球蛋白含量對比，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 給藥30周，甘草次酸低、中、高劑量組血清球蛋白含量均低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在停藥4周，3個劑量組血清球蛋白較前無顯著變化、仍低于正常對照組；3組之間差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠血清球蛋白含量對比

表5 各組大鼠血清球蛋白含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組636．13±1．8335．27±3．7234．67±2．4935．5±2．8036．40±1．12低劑量組635．07±1．9234．08±3．8436．86±1．4327．43±2．78?29．88±4．85?中劑量組636．72±2．6134．58±3．7836．47±2．5528．07±2．41?29．94±4．45?高劑量組634．40±3．4134．08±3．0835．46±2．3227．58±2．0?28．05±2．78?

注：與正常對照組對比，*P<0.05。

2.3 各組大鼠血清總膽紅素和堿性磷酸酶含量對比

2.3.1 血清總膽紅素

在各時間點，各組間血清總膽紅素對比，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同一個劑量組在不同時間點的對比亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 各組大鼠血清總膽紅素含量對比

表6 各組大鼠血清總膽紅素含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組61．37±0．761．28±0．671．16±0．921．45±0．791．55±0．56甘草次酸低劑量組61．54±10．591．23±0．991．92±0．801．98±0．551．75±0．80甘草次酸中劑量組61．31±0．451．35±1．241．38±0．721．80±1．241．73±0．61甘草次酸高劑量組61．46±1．071．14±0．432．03±0．682．08±0．471．96±0．43

2.3.2 血清堿性磷酸酶

在各時間點，各組間堿性磷酸酶對比，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同一個劑量組在不同時間點的對比亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 各組大鼠血清堿性磷酸酶含量對比

表7 各組大鼠血清堿性磷酸酶含量對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組6155．0±45．06163．75±72．67178．0±52．98177．75±65．93156．50±40．42甘草次酸低劑量組6145．75±30．23177．25±43．70172．0±80．14152．17±41．05160．85±41．04甘草次酸中劑量組6153．25±28．15176．75±66．77172．17±79．13161．83±42．90169．43±37．59甘草次酸高劑量組6178．5±54．44177．50±33．64189．33±90．74208．50±70．38166．83±39．43

2.4 各組大鼠肝臟臟器指數(shù)變化對比

在各時間點，甘草次酸3個劑量組大鼠肝臟組織肉眼觀察未見明顯改變，肝臟臟器指數(shù)與正常對照組對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在同一觀測時間點上，低、中、高3個劑量組之間兩兩比較，差別亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表8。

表8 各組大鼠肝臟臟器指數(shù)變化對比

表8 各組大鼠肝臟臟器指數(shù)變化對比

組 別動物數(shù)6周14周22周30周停藥4周正常對照組64．91±0．454．94±0．585．10±0．565．25±0．975．17±0．89甘草次酸低劑量組65．42±1．045．57±1．025．72±0．676．03±0．795．91±1．13甘草次酸中劑量組65．44±0．665．36±0．765．84±0．366．21±1．035．89±0．69甘草次酸高劑量組65．75±1．125．65±0．875．98±0．796．11±0．796．14±0．86

2.5 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學改變

正常對照組大鼠肝臟切片HE染色光鏡下可見：肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，肝小葉結構完整，肝竇清晰,肝索排列整齊，肝細胞完整、排列規(guī)則(圖1)。給藥6周時，甘草次酸低、中、高劑量組肝臟組織HE染色見肝小葉結構清晰完整，肝索排列整齊，無炎性細胞浸潤，無纖維增生，無細胞水腫，門管區(qū)小葉間動脈、小葉間靜脈及小葉間膽管結構完整無擴張(圖2a～2c)。此后，隨著甘草次酸的持續(xù)干預，在14周及22周時間點，3個劑量組大鼠肝臟組織形態(tài)無明顯變化(圖3a～3c,圖4a～4c)。直至給藥終點(第30周)，低、中、高劑量組肝臟未見顯著病理改變，肝小葉結構完整清晰，肝索排列整齊，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，門管區(qū)內小葉間動脈，小葉間靜脈和小葉間膽管規(guī)則(圖5a～5c)。停藥4周后，低、中、高劑量組肝臟組織形態(tài)學觀察與正常對照組無顯著差異：肝小葉完整，肝索排列整齊，肝細胞形態(tài)完整、以中央靜脈為中心呈放射狀排列(圖6a～6c)。

圖1 肝臟組織(HE，×200)

3 討 論

18β-甘草次酸的五環(huán)三萜結構使其具有糖皮質激素樣作用而無嚴重不良反應，因此被廣泛應用于臨床，如用于各種急慢性肝炎、肝纖維化、肝癌等疾病。此外，它還具有防癌、抗癌、誘導干擾素、調節(jié)細胞免疫等作用[11]。甘草次酸的類激素樣作用通過兩個途徑實現(xiàn)：甘草次酸作為甾體激素代謝失活酶抑制劑，可抑制Ⅰ型11β-羥化甾體脫氫酶(Ⅰ型11β-HSD)、Ⅱ型11β-HSD、3HSD及17HSD等，使體內皮質激素代謝減少從而提高內源性和外源性皮質激素的含量[5,12-13]；此外，由于甘草次酸具有類似于甾體激素的化學結構，故可作為配體直接與皮質激素受體結合[5,14-15]。

機體內多個臟器組織均存在甘草次酸的特異性結合位點，肝臟的甘草次酸結合位點活性最高，甘草次酸與肝細胞膜上該位點的結合具有高度特異性及可飽和性[16]，此是甘草次酸用于臨床多種肝臟疾病治療的結構基礎。Rahman[17]以醋酸鉛誘導建立肝癌大鼠模型，發(fā)現(xiàn)甘草酸可顯著降低AST和ALT等轉氨酶水平，并提高還原型谷胱甘肽及其相關酶類的水平。Kazuk等[18]報道了甘草酸可顯著抑制LPS和D-半乳糖苷兩種小鼠肝損傷模型中ALT和AST的增加。Lee等[19]發(fā)現(xiàn)在小鼠四氯化碳肝損傷模型中，甘草次酸可顯著降低血清轉氨酶、TNF-α及丙二醛水平。

在肝臟疾病治療中，甘草次酸改善肝功能、降低轉氨酶及升高清蛋白的療效已得到大量的實驗驗證及臨床病例證實。基于甘草次酸的肝臟靶向特點，可以推測甘草次酸對正常大鼠肝細胞也可能產(chǎn)生保護作用或不良反應，甚至毒副作用。本實驗給正常大鼠以甘草次酸灌胃，在加大甘草次酸劑量(正常劑量的5倍、10倍、20倍)及延長用藥時間(30周)雙因素作用下，血清轉氨酶、清蛋白、堿性磷酸酶及膽紅素未見顯著升高；用藥至30周時，各組間ALT水平差別仍無統(tǒng)計學意義，AST有小幅度上升(最高值：30周時高劑量組為189.50±113.88 U/L)，但與正常對照組(137.25±46.59U/L)對比，差別無統(tǒng)計學意義,尚可認為轉氨酶無顯著升高。而 AST的升高趨勢，推測是由于甘草次酸促進了肝細胞線粒體的滲透轉運，線粒體中的AST釋放至胞質。Salvi[20]報道甘草次酸可導致肝細胞線粒體腫脹、滲透性轉變，線粒體內細胞色素c及凋亡誘導因子釋放；此后該作者還報道了甘草次酸的衍生物甘珀酸同樣具有類似作用[21]。Cristina等人通過大鼠肝細胞線粒體體外干預試驗發(fā)現(xiàn)：甘草次酸通過與線粒體呼吸鏈相互作用、產(chǎn)生過氧化氫并氧化硫醇基和內源性嘧啶核苷酸，從而導致線粒體過渡孔開放，推測是甘草次酸C-11位上的羧基與線粒體復合物I的F/S中心相結合，形成一個以氧為中心的自由基而產(chǎn)生促氧化反應。

本實驗結果顯示：血清清蛋白未見明顯變化,但血清球蛋白具有降低趨勢，即在6周、14周及22周時，均可觀察到甘草次酸干預組較正常對照組減低，但差別尚無統(tǒng)計學意義；而在用藥30周后干預組球蛋白水平顯著低于正常對照組；即使停藥4周后，這種差異仍然顯著、具有統(tǒng)計學意義。血清總蛋白的變化與球蛋白相一致。球蛋白由淋巴細胞產(chǎn)生，包括免疫球蛋白和補體、多種糖蛋白、金屬結合蛋白、多種脂蛋白及酶類，一般可分為α1、α2、β、γ 4種成分。球蛋白與機體免疫功能、血漿黏度密切相關。Haggag[22]發(fā)現(xiàn)甘草的提取物甘草酸可顯著抑制小鼠哮喘模型中IgE的表達、減少組胺釋放。Kimura[23]報道了β-甘草次酸對補體活化的直接抑制作用并降低循環(huán)免疫復合物水平。在本研究中，給藥至22周時球蛋白尚無顯著降低，直至給藥30周時才明顯低于正常對照組，這與長期應用腎上腺皮質激素所導致的球蛋白合成減少一致，也側面顯示了甘草次酸的類腎上腺皮質激素樣作用，提示在長期的治療過程中應注意其免疫抑制作用可能會導致球蛋白低于正常值而影響機體的免疫功能。

本實驗中，各組間大鼠肝臟組織未見明顯的形態(tài)學差異，至用藥30周時，甘草次酸低、中、高劑量組肝索排列整齊規(guī)則，肝小葉結構尚清晰，肝細胞完整、無水腫及壞死，門管區(qū)小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管管腔無擴張或狹窄，管壁無水腫。結合肝臟組織形態(tài)及肝功能指標的表現(xiàn)，可以認為在30周給藥時間內給予較大劑量(25 μg/g，50 μg/g，100 μg/g)甘草次酸灌胃對大鼠肝功能及肝臟組織形態(tài)無顯著毒副作用，提示甘草次酸的用藥劑量及用藥時間有較大的安全空間可供選擇。但需要重視的是：個體對甘草次酸的敏感性差異很大。Stφrmer[24]報道：在健康人群中，對甘草次酸敏感性高者每日口服100 mg甘草次酸即可出現(xiàn)不良反應，而大多數(shù)人每日口服量達400 mg仍無明顯異常表現(xiàn)。

雖然本實驗尚未發(fā)現(xiàn)甘草次酸對正常大鼠肝臟的明顯毒副作用，但大劑量甘草次酸引起全身其他臟器損害的報道較多見，如腎損害、高血壓、水鈉潴留及低鉀血癥等[25-26]。為進一步了解甘草次酸的不良反應，需結合個體敏感性、全身各臟器組織形態(tài)及功能進行綜合評估，為臨床用藥提供更詳實、可靠的數(shù)據(jù)支持，以期充分發(fā)揮祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥的優(yōu)勢，開發(fā)其巨大的藥用潛質。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)01-0062-06

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.01.32

張小兵，教授，主任醫(yī)師，790736924@qq.com

國家自然科學基金項目(81160449)

2014-09-01；

2014-11-24