新耐藥基因HA117在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

陳建飛金先慶

新耐藥基因HA117在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

陳建飛1金先慶2

HA117；基因；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；MDR1；免疫組織化學(xué)

全反式維甲酸（ATRA）是我國(guó)學(xué)者首先使用的白血病化療藥物及實(shí)體瘤輔助化療藥物[1]。在肯定ATRA對(duì)惡性腫瘤的療效時(shí)，ATRA在使用后存在誘導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的現(xiàn)象也同樣受到廣泛的關(guān)注[2-3]。本課題組在建立HL-60/ATRA耐藥株的基礎(chǔ)上成功篩選并發(fā)現(xiàn)一未知的耐藥新基因，并命名為HA117（Genebank Number：CB214920）。在前期研究[4]中，我們已成功構(gòu)建攜帶HA117基因的重組腺病毒和其沉默質(zhì)粒，并驗(yàn)證了HA117具有明顯的多藥耐藥功能。在此基礎(chǔ)上，我們成功構(gòu)建HA117多克隆抗體[5]，并檢測(cè)在結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等組織中有較強(qiáng)的表達(dá)[6]。為進(jìn)一步檢測(cè)HA117蛋白在兒童實(shí)體腫瘤中的表達(dá)，初步分析其耐藥機(jī)制，本研究應(yīng)用S-P免疫組化法，檢測(cè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中HA117蛋白的表達(dá)情況，分析其臨床病理意義，并與MDR1基因做比較，初步分析其耐藥機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2009年—2012年神經(jīng)母細(xì)胞瘤標(biāo)本30例，男18例，女12例，年齡5個(gè)月～6歲，平均3.81歲。病理分型：預(yù)后良好型（FH型）16例，預(yù)后不良型（uFH）10例，其余4例由于標(biāo)本原因未分型。明確有伴淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者11例。每例均由兩名重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院資深病理科醫(yī)師做病理診斷。

1.2 試劑及儀器 HA117多克隆抗體（本實(shí)驗(yàn)室保存）；MDR1單克隆抗體（南京博士德生物公司，2012090701）；KIT-9921即用型免疫組化（402141211），EliVision TM Super試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，20120201）。組織包埋機(jī)，組織切片機(jī)，微波爐，4℃冰箱，顯微鏡等。

1.3 方 法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法 所有標(biāo)本均用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，厚5μm連續(xù)切片，貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的切片，之后60℃烤片18h。切片經(jīng)脫蠟水化，用0.01mol檸檬酸緩沖液（pH6.0）進(jìn)行微波加熱抗原修復(fù)，3%雙氧水滅活過(guò)氧化物酶，BSA封閉抗原，以1：100比例稀釋濃縮型第一抗體，滴加40μL一抗后4℃冰箱過(guò)夜。PBS沖洗后分別滴加生物素標(biāo)記的二抗和SP復(fù)合物放大效應(yīng)，DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間并中止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片。

1.3.2 結(jié)果判定 HA117表達(dá)呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性，每片觀察5個(gè)40倍光鏡下視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)試劑公司提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于10%腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)呈棕黃色為陰性表達(dá)（-），10%~25%為低度表達(dá)（+），25%~75%為中度表達(dá)（++），>75%為高度表達(dá)（+++）；中高度表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表示腫瘤對(duì)該耐藥基因所介導(dǎo)的藥物具有耐受性；MDR1以相同方法判定。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HA117蛋白表達(dá) HA117蛋白主要在細(xì)胞胞漿中表達(dá)，呈棕黃色或棕褐色表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率70%，瘤旁正常組織的表達(dá)率為21%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1、圖1～2（封三）。

2.2 HA117蛋白表達(dá)與Shimada病理分期的關(guān)系按照Shimada病理分期法把神經(jīng)母細(xì)胞瘤分為FH型（Favorable Histology Group）和uFH型（UnfavorableHistology Group）兩種[7]。30例神經(jīng)母細(xì)胞瘤中有16例FH型，10例uFH型，其余4例因?yàn)闃?biāo)本原因未進(jìn)行分期。其中FH型中有HA117蛋白表達(dá)8例，表達(dá)率50%，uFH型10例全部表達(dá)，表達(dá)率100%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表1 HA117在神經(jīng)母細(xì)胞瘤及非瘤組織表達(dá)情況（例）

表2 HA117在神經(jīng)母細(xì)胞瘤不同病理分型表達(dá)情況（例）

2.3 HA117與MDR1蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織表達(dá) 30例神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織HA117陽(yáng)性表達(dá)率70%，MDR1表達(dá)率為60%，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HA117主要在細(xì)胞胞漿表達(dá)，MDR1主要在細(xì)胞胞膜表達(dá)。見表3，圖3～4（封三）。

表3 HA117與MDR1蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤表達(dá)（例）

3 討 論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童中最常見的顱外實(shí)體瘤，多發(fā)生于腎上腺、盆腔和頭頸部，預(yù)后極差[7]?；熓巧窠?jīng)母細(xì)胞瘤綜合治療中的重要方法。但在神經(jīng)母細(xì)胞瘤化療當(dāng)中，耐藥問(wèn)題突出，因此也越來(lái)越引起重視。有研究[8]表明神經(jīng)母細(xì)胞瘤的耐藥機(jī)制并非單一機(jī)制引起，可能是MDR1、GST-π等多種基因協(xié)同作用的結(jié)果。有研究表明，神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，MDR1、GST-π存在高表達(dá)，說(shuō)明神經(jīng)母細(xì)胞瘤存在耐藥性，并且耐藥機(jī)制可能存在多種機(jī)制。

新耐藥基因HA117作為近幾年新發(fā)現(xiàn)的耐藥基因，對(duì)于腫瘤耐藥基因譜是一個(gè)補(bǔ)充。HA117基因已經(jīng)被證明在多種實(shí)體腫瘤與非實(shí)體腫瘤中存在不同程度的表達(dá)，并證明參與腫瘤的多藥耐藥[9-11]。但在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及耐藥機(jī)制未被研究。

本研究結(jié)果顯示，神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，HA117的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明神經(jīng)母細(xì)胞瘤存在多藥耐藥。神經(jīng)母細(xì)胞瘤Shimada分型分為FH型和uFH型。有研究表明，MDR1、TopoII、LRP在uFH中表達(dá)比FH顯著增強(qiáng)，提示uFH型神經(jīng)母細(xì)胞瘤對(duì)化療藥物耐藥性更為顯著，本研究發(fā)現(xiàn)，uFH型神經(jīng)母細(xì)胞瘤中HA117表達(dá)明顯增高FH型，結(jié)果有顯著差異性。表明uFH型神經(jīng)母細(xì)胞瘤更具有耐藥性，可以考慮在化療前進(jìn)行ATRA誘導(dǎo)，以取得更好的化療效果。HA117基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)與經(jīng)典耐藥基因MDR1無(wú)顯著差異，但從表達(dá)部位看，HA117主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿，MDR1主要存在在細(xì)胞胞膜。目前研究表明，MDR1的主要作用機(jī)制是通過(guò)膜蛋白將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞，從而引起腫瘤耐藥，HA117主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿，推測(cè)作用機(jī)制可能是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的代謝機(jī)制降低胞內(nèi)的藥物濃度，從而引起腫瘤耐藥。HA117蛋白的高表達(dá)，是相繼MDR1、GST-π、TopoII后，對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐藥原因的重要補(bǔ)充。為選擇腫瘤敏感藥物時(shí)，是否選擇ATRA進(jìn)行誘導(dǎo)提供依據(jù)。

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（收稿：2015-01-28 修回：2015-05-05）

1浙江省嘉興市婦幼保健院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房（嘉興314000）；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院普外科（重慶 410000）

金先慶，Tel：15105731339；