細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的價值

張博茗，林元強(qiáng)，隋國慶，王 洋，趙倩倩，王 輝

吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院超聲科，吉林 長春 130033

細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的價值

張博茗，林元強(qiáng)，隋國慶，王 洋，趙倩倩，王 輝

吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院超聲科，吉林 長春 130033

王輝，主任醫(yī)師，教授，吉林大學(xué)博士研究生導(dǎo)師。現(xiàn)任吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院超聲科主任，中華醫(yī)學(xué)會超聲醫(yī)學(xué)分會委員，中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會常務(wù)理事，吉林省超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會會長，吉林省醫(yī)學(xué)會超聲醫(yī)學(xué)分會主任委員。主要從事腹部超聲、超聲造影及介入超聲診斷與治療的臨床工作及研究。2012年被中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會授予優(yōu)秀超聲醫(yī)學(xué)專家獎。擔(dān)任《中華超聲影像學(xué)志》、《中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)雜志》、《中國臨床醫(yī)學(xué)影像雜志》、《中國實驗診斷學(xué)雜志》、《中國老年醫(yī)學(xué)雜志》和《吉林醫(yī)學(xué)雜志》編委。先后主持省部級科研項目3項，獲省教育廳教學(xué)成果一等獎1項、三等獎3項，獲吉林大學(xué)醫(yī)療成果二等獎3項、三等獎5項。至今已發(fā)表學(xué)術(shù)論文100余篇，其中SCI收錄論文8篇。

目的：研究細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)(fine-needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC)聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的應(yīng)用價值。方法：收集2014年6月—2015年6月因甲狀腺結(jié)節(jié)至吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診且經(jīng)超聲檢查可疑惡性的患者87例，均行超聲引導(dǎo)下FNAC檢查和穿刺標(biāo)本BRAFV600E突變熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測。結(jié)果：術(shù)后病理診斷為惡性的64例患者中，術(shù)前FNAC陽性48例、陰性16例；BRAFV600E突變40例。術(shù)后病理診斷為良性的23例患者中，術(shù)前FNAC陽性5例、陰性18例；BRAFV600E突變0例。與術(shù)后病理結(jié)果對照，F(xiàn)NAC對甲狀腺癌診斷的靈敏度為75.0%、特異度為78.3%、準(zhǔn)確率為75.9%；BRAFV600E突變檢測的靈敏度為62.5%、特異度為100%、準(zhǔn)確率為72.4%；FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測的靈敏度為89.1%、特異度為78.3%、準(zhǔn)確率為86.2%。結(jié)論：FNAC聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測可提高甲狀腺惡性結(jié)節(jié)診斷的靈敏度。

甲狀腺結(jié)節(jié)；細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)；BRAF基因突變檢測

【Key words】 Thyroid nodule; Fine-needle aspiration cytology; BRAF mutation detection

甲 狀 腺 乳 頭 狀 癌 (papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲狀腺癌中最多見的類型，占甲狀腺癌的80%～90%[1-2]。目前，甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(fine-needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC)以其微創(chuàng)、易行、準(zhǔn)確率高的特點，成為臨床上診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性最常用的方法。但由于細(xì)針穿刺所獲標(biāo)本量有限，不能反映病變的全貌，且診斷依賴操作醫(yī)師及病理醫(yī)師的經(jīng)驗，文獻(xiàn)報道假陰性率在20%左右[3]。因此，尋求一種能提高FNAC對甲狀腺惡性結(jié)節(jié)診斷率的方法勢在必行。

BRAF基因位于人染色體7q34，編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶。其突變大多位于第1 799位點腺嘌呤替代了胸腺嘧啶，導(dǎo)致激酶活性片段第600位谷氨酸取代了纈氨酸，從而持續(xù)激活BRAF激酶，引起持續(xù)的絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase，MEK)磷酸化和下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤形成。在多數(shù)文獻(xiàn)報道中，BRAFV600E突變與腫瘤的發(fā)生、分化及侵襲性有關(guān)，常見于PTC，且是后者最常見的遺傳學(xué)事件。但BRAFV600E在甲狀腺惡性結(jié)節(jié)中突變率低，尚不能滿足臨床診斷需求。如果部分FNAC未能檢測出明確診斷的惡性結(jié)節(jié)中存在BRAFV600E突變，而突變能通過細(xì)針穿刺標(biāo)本檢出，那么理論上兩者相結(jié)合用于診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)應(yīng)較單獨FNAC更具有臨床意義。因此，本研究探討FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測在甲狀腺結(jié)節(jié)定性診斷方面的臨床價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究中87份樣本來自2014年6月—2015年6月至吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診的經(jīng)超聲檢查認(rèn)為具有可疑惡性特征的甲狀腺結(jié)節(jié)患者。其中男性28例、女性59例；年齡27～72歲，平均年齡(41.7±9.6)歲。結(jié)節(jié)大小1.0～2.5 cm。超聲表現(xiàn)為實性低回聲的結(jié)節(jié)87個，形態(tài)不規(guī)則的結(jié)節(jié)51個，縱橫比＞1的結(jié)節(jié)33個，內(nèi)可見微鈣化或砂礫樣鈣化的結(jié)節(jié)37個，血流豐富的結(jié)節(jié)15個，伴頸部淋巴結(jié)形態(tài)異常的結(jié)節(jié)19個。

1.2 穿刺方法

患者排除FNAC禁忌證，術(shù)前簽署知情同意書。取仰臥位，肩部墊高15°～30°，保持頭頸部過伸位。超聲下定位穿刺點，皮膚消毒，鋪無菌洞巾，2%利多卡因局部麻醉，使用TSK一次性負(fù)壓吸引穿刺針(21G)，超聲引導(dǎo)下沿預(yù)定針道進(jìn)入結(jié)節(jié)中心，負(fù)壓狀態(tài)下多點抽吸≥5次，標(biāo)本涂片3～4張，95%乙醇固定(圖1)。

圖1 超聲引導(dǎo)下FNAC

1.3 細(xì)胞學(xué)診斷方法

按照甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda分類標(biāo)準(zhǔn)：① 標(biāo)本不滿意或不能診斷；② 良性；③ 不能明確意義的不典型病變或濾泡性病變；④ 濾泡性新生物；⑤ 可疑惡性；⑥ 惡性。本研究將⑤、⑥ 統(tǒng)一歸類為細(xì)胞學(xué)陽性，將①～④歸類為細(xì)胞學(xué)陰性(圖2)。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌FNAC涂片

1.4 BRAF基因突變檢測

根據(jù)組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書提取DNA。用BRAFV600E突變檢測試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司)將DNA樣本與聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)緩沖液、引物探針等制成反應(yīng)液，利用熒光定量PCR儀對熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行檢測，計算ΔCt值(ΔCt值=突變檢測Ct值-質(zhì)控檢測Ct值)，結(jié)果定性分析(圖3)。

圖3 BRAFV600E突變樣本檢測圖

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)病理結(jié)果

87例甲狀腺結(jié)節(jié)患者全部經(jīng)手術(shù)切除。術(shù)后病理為：惡性64例中，乳頭狀癌63例、濾泡狀癌1例；良性23例全部為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，其中5例伴局部濾泡上皮異型增生。

2.2 FNAC與術(shù)后病理對照

與術(shù)后病理對照，術(shù)前FNAC診斷甲狀腺癌的靈敏度為75.0%(48/64)，特異度為78.3% (18/23)，準(zhǔn)確率為75.9%(66/87)。詳見表1。

2.3 BRAFV600E突變檢測與術(shù)后病理對照

術(shù)后病理診斷為惡性的64例患者中，術(shù)前檢測到BRAFV600E突變40例；術(shù)后病理診斷為良性的23例患者中，術(shù)前未檢測到BRAFV600E突變。且術(shù)前檢測出BRAFV600E突變的40例患者術(shù)后病理均證實為乳頭狀癌。

與術(shù)后病理對照，BRAFV600E突變檢測診斷甲狀腺癌的靈敏度為62.5%(40/64)，特異度為100%(23/23)，準(zhǔn)確率為72.4%(63/87)。詳見表2。

表1 術(shù)前FNAC與術(shù)后病理結(jié)果對照

表2 術(shù)前BRAFV600E檢測與術(shù)后病理結(jié)果對照

2.4 FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測與術(shù)后病理對照

FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測診斷甲狀腺癌的靈敏度為89.1%(57/64)，特異度為78.3% (18/23)，準(zhǔn)確率為86.2%(75/87)。均高于單獨BRAFV600E突變檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表3。FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測的靈敏度高于單獨FNAC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，兩者特異度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，準(zhǔn)確率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表4。而FNAC與BRAFV600E突變均為陽性的31例患者術(shù)后病理全部為惡性。

表3 術(shù)前FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測與術(shù)后病理結(jié)果對照

表4 術(shù)前FNAC、BRAFV600E突變檢測與兩者聯(lián)合的診斷率比較

3 討 論

超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)FNAC檢查作為臨床最常用的甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別方法，具有快捷、準(zhǔn)確率高的優(yōu)勢。對于有經(jīng)驗的醫(yī)師，F(xiàn)NAC的靈敏度波動于65%～98%，平均值約為83%，特異度波動于72%～100%[4]。但其仍有一定局限性：如病理呈不典型表現(xiàn)，無乳頭狀結(jié)構(gòu)或細(xì)胞核僅輕微改變，造成乳頭狀癌的假陰性；由于細(xì)針穿刺所獲標(biāo)本量有限，且標(biāo)本中的組織形態(tài)和細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)大部分或完全破壞，不能反映腫瘤外血管或包膜的侵犯程度，無法鑒別濾泡狀腺瘤與濾泡狀癌；或者結(jié)節(jié)內(nèi)部血流豐富，過多紅細(xì)胞污染涂片；另外，操作醫(yī)師及病理醫(yī)師的經(jīng)驗也對FNAC結(jié)果有較大影響。本研究顯示，單獨FNAC的靈敏度為75.0%，16例乳頭狀癌患者被診斷為良性，因穿刺過程中未取得結(jié)節(jié)中惡性病變部位所致；FNAC的特異度為78.3%，5例假陽性患者細(xì)胞病理發(fā)現(xiàn)異型性或乳頭狀增生，診斷為乳頭狀癌或傾向于乳頭狀癌，但術(shù)后病理未達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，F(xiàn)NAC診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的正確率尚不能完全滿意。

BRAFV600E突變與乳頭狀癌的發(fā)生有著密切關(guān)系，文獻(xiàn)報道29%～83%的乳頭狀癌可檢測出BRAFV600E突變[5-7]，而良性病變則不表達(dá)。本研究術(shù)前發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變的40例患者經(jīng)術(shù)后病理證實均為乳頭狀癌，且良性病變23例均未發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變，表明BRAFV600E突變是與良性病變無關(guān)的遺傳學(xué)事件。盡管BRAFV600E突變診斷乳頭狀癌的特異度為100%，但其突變率低導(dǎo)致靈敏度及準(zhǔn)確率均低于FNA，因此也不能滿足臨床診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的需求。

由于檢測到BRAFV600E突變即可診斷為乳頭狀癌，在FNAC基礎(chǔ)上聯(lián)合BRAFV600E突變檢測，不會增加假陽性率，兩者特異度無差別。乳頭狀癌在臨床發(fā)現(xiàn)的甲狀腺癌中占絕大多數(shù)(80%～90%)，提高乳頭狀癌檢出率能間接提高甲狀腺癌的術(shù)前檢出率。對于部分病理呈不典型改變、FNAC未作出惡性診斷的結(jié)節(jié)，可檢測到BRAFV600E突變，那么FNAC聯(lián)合BRAFV600E突變檢測與單獨FNAC比較，能提高甲狀腺癌的檢出率(靈敏度)，本研究的靈敏度由75.0%提升至89.1%。且FNAC與BRAFV600E突變檢測均為陽性的患者，術(shù)后病理證實準(zhǔn)確率為100%。BRAFV600E突變檢測雖然對良性結(jié)節(jié)診斷無意義，但理論上可通過提高惡性結(jié)節(jié)的檢出率提升診斷的總體符合率。本研究中準(zhǔn)確率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義的原因可能與樣本量有限有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

此外，BRAFV600E突變與乳頭狀癌對周圍組織的高侵襲性相關(guān)，是中央組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的預(yù)測因子，還可引起腫瘤細(xì)胞對放射性碘的攝取力降低，導(dǎo)致放射性碘治療失敗，是判斷預(yù)后的影響因子[8-9]。因此，術(shù)前FNAC檢查不但能提高甲狀腺癌的檢出率，還能提示病變的惡性程度，并為預(yù)后評估提供依據(jù)。

4 結(jié) 語

綜上所述，甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺檢測BRAFV600E突變方法可靠，與FNAC聯(lián)合能提高甲狀腺惡性結(jié)節(jié)診斷的靈敏度，同時可能有助于篩選出高危甲狀腺癌病例，指導(dǎo)手術(shù)方式及術(shù)后選擇后續(xù)治療方案。

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ZHANG Boming, LIN Yuanqiang, SUI Guoqing, WANG Yang, ZHAO Qianqian, WANG Hui (Department of Ultrasound, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Jilin Province, China)

WANG Hui E-mail: wanghui19620708@aliyun.com

Objective:To investigate the application value of fine-needle aspiration cytology (FNAC) combined with BRAF mutation detection in the diagnosis of thyroid nodules.Methods:A total of 87 patients who were diagnosed as suspicious malignant thyroid nodules by ultrasonic examination from June 2014 to June 2015 were selected. All the patients underwent FNAC and BRAF mutation detection by fluorescence polymerase chain reaction (PCR).Results:Among 64 malignant cases, 48 cases were positive and 16 cases were negative for FNAC, and 40 cases had BRAFV600Emutation. Among 23 benign cases, 5 cases were positive and 18 cases were negative for FNAC, and no case had BRAFV600Emutation. Compared with the postoperative pathological results, the sensitivity was 75.0%, the specificity was 78.3%, and the accuracy was 75.9% for FNAC. The sensitivity of BRAF mutation detection was 62.5%, the specificity was 100.0%, and the accuracy was 72.4%. The sensitivity was 89.1%, the specificity was 78.3%, and the accuracy was 86.2% for FNAC combined with BRAFV600Emutation detection.Conclusion:FNAC combined with BRAFV600Emutation detection can improve the sensitivity of diagnosis of malignant thyroid nodules.

R445.1

A

1008-617X(2015)04-0259-05

2015-11-30）

吉林省科技發(fā)展計劃項目(No：20130206020SF)

王輝 E-mail：wanghui19620708@aliyun.com

The value of fine-needle aspiration cytology combined with BRAFV600E mutation detection in diagnosis of thyroid nodules