不同近交系數(shù)的蝦夷扇貝近交衰退研究?

傅 強， 王 師， 趙 亮， 張 璐， 包振民

(中國海洋大學海洋生命學院，海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

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不同近交系數(shù)的蝦夷扇貝近交衰退研究?

傅 強， 王 師??， 趙 亮， 張 璐， 包振民

(中國海洋大學海洋生命學院，海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

在蝦夷扇貝中通過自體受精構建了近交系數(shù)為0.5的自交家系，同時構建了近交系數(shù)為0.25的F2代近交家系和雜交對照家系，對生活史不同時期的生長和存活等適應性性狀進行了近交效應的研究。研究發(fā)現(xiàn)不同的近交系數(shù)對不同性狀的衰退影響不同：幼蟲期生長性狀的近交負荷為0.158～0.279，而存活率的近交負荷為0.915～1.101，存活率受近交的影響更大。兩種性狀的近交衰退從幼蟲第16天才開始明顯顯現(xiàn)，并且近交負荷隨著時間都有增大的趨勢，到成體時分別增長為0.348～0.588和1.485～3.277。本研究表明，在蝦夷扇貝中近交系數(shù)越高衰退越嚴重，存活率性狀的衰退相比生長性狀更嚴重，并且近交負荷都隨著時間顯著增大。

蝦夷扇貝；自體受精；近交衰退；適應性性狀；遺傳負荷

有親緣關系的個體之間的交配通常會導致一些與生物適應性相關的性狀表型降低，這種現(xiàn)象被稱為近交衰退(Inbreeding depression)，最早是由Charlesworth[1]提出。雖然近交衰退帶來的直接結果幾乎都是有害的，但通過對近交的研究有助于幫助我們理解基因純化進程中的規(guī)律和近交衰退的機理，以便于合理利用近交構建純系、加快育種進程并減少或避免近交衰退；對近交負荷的研究同時也能幫助理解進化及物種保護等眾多遺傳學和交配系統(tǒng)進化等問題。因此近交衰退一直以來都是遺傳育種學、進化生物學，保護遺傳學和生態(tài)學等領域的研究熱點。

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)自1982年引入中國以來[2]，已經(jīng)成為中國北方最重要的海水養(yǎng)殖貝類之一。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，蝦夷扇貝養(yǎng)殖群體逐漸出現(xiàn)了育苗成活率低、病害頻發(fā)、高死亡率等現(xiàn)象[3]。許多學者都認為，由于種群內(nèi)多代連續(xù)近交導致的蝦夷扇貝種質退化，是產(chǎn)生上述現(xiàn)象的主要原因[4-5]。

蝦夷扇貝本身雖為雌雄異體，但近年來在養(yǎng)殖群體中發(fā)現(xiàn)了一定比例的雌雄同體現(xiàn)象[6]。雖然這種雌雄同體產(chǎn)生的機制尚不明確，但無論哪種雌雄比例的性腺，都可以同時產(chǎn)生成熟的精、卵細胞。自體受精為研究蝦夷扇貝近交衰退提供了很好的材料，國內(nèi)也已有學者對蝦夷扇貝自體受精的繁殖生物學做了初步研究[6-7]，但在蝦夷扇貝中仍缺乏系統(tǒng)的近交衰退相關研究。針對這一現(xiàn)狀，作者于2012年利用不同的交配策略構建了不同近交系數(shù)的蝦夷扇貝家系材料，通過記錄各不同時期的不同性狀衰退研究，探討近交衰退在蝦夷扇貝中的表現(xiàn)及規(guī)律，為蝦夷扇貝近交衰退研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于構建家系的蝦夷扇貝親貝包含以下3種：(1)普通蝦夷扇貝養(yǎng)殖群體二齡個體；(2)本實驗室前期(2010年)構建的蝦夷扇貝全同胞家系二齡子代個體；(3)雌雄同體的蝦夷扇貝(雌雄性腺比約20∶1～40∶1)。親貝于2012年1月由大連獐子島海區(qū)轉移至獐子島集團原良種廠車間進行60 d的積溫促熟，促熟結束后挑選性腺肥滿、活力好且外型規(guī)則的種貝做親本。所有選擇用于家系構建的親貝均為二齡且大小無顯著差異。

1.2 實驗設計

1.2.1 實驗分組 本研究共分為3個實驗組，雜交對照組、F2代近交組和自體受精的自交組，分別編號為A、B、C。根據(jù)通徑計算的原理和萊特公式可以得出，3組的近交系數(shù)F分別為0、0.25、0.5。每組分別建立3個家系作為平行樣，每個家系分3桶培育以消除桶間誤差。

1.2.2 實驗取樣及性狀選擇 本實驗所研究的與適應性相關的性狀包括：受精率、孵化率、幼蟲不同時期的存活率和殼長大小，以及成體不同時期的存活率和大小。計算方法如下：

受精率=(產(chǎn)生第一極體的受精卵數(shù)÷總卵數(shù))×100%；

孵化率=(D形幼蟲數(shù)÷受精卵數(shù))×100%；

幼蟲存活率=(取樣時幼蟲總數(shù)目÷初選幼后幼蟲總數(shù)目)×100%；

成體存活率=(取樣時成體總個數(shù)÷轉移至海上養(yǎng)殖時總數(shù)目)×100%；

生長性狀以殼長為代表，每次以家系為單位從不同桶中混合取樣30個個體。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 不同實驗組之間的性狀比較采用多重比較分析。方差分析采用單因素方差分析(ANOVA)。在分析之前，所有的生長性狀值都轉化為其自然對數(shù)，孵化率等以百分比表示的性狀值轉化成其反正弦函數(shù)，以增加數(shù)據(jù)的正態(tài)性。方差分析采用SPSS17軟件，近交衰退率的差異比較采用t檢驗，差異的顯著性閾值設為0.05。

近交衰退率的計算采用公式：

式中:δx為近交衰退率；sx為近交組x的表型均值；Mx為對照組的表型均值。

近交負荷的計算方法為某性狀均值的自然對數(shù)對近交系數(shù)F的回歸斜率[1]，參照公式：

lnZ0-lnZx=B×F。

式中：Z0為對照組的性狀均值；Zx為近交組對應的性狀均值；F為近交系數(shù)；B為近交負荷。

1.3 實驗方法

1.3.1 家系的構建 A、B組分別隨機挑選雌雄親貝各3個，C組挑選雌雄同體親貝3個，刷洗干凈后置于陰涼通風處陰干1.5 h，雌雄親貝分別放置于對應的100 L/25 L塑料桶內(nèi)催產(chǎn)。催產(chǎn)水溫為12 ℃，采用充氣加攪拌的方法刺激產(chǎn)卵/產(chǎn)精。開始產(chǎn)卵/產(chǎn)精2 h后將親貝拿出，按照預先設計的方案進行受精：C組雌雄同體自交組在桶內(nèi)自體受精，A、B組3個雌性親本各隨機挑選1個雄性親本的精子受精。加入的精子量以每個卵子周圍有3～5個為宜，通過顯微鏡鏡檢受精情況。

1.3.2 孵化和幼蟲培育 孵化期間胚胎密度控制在100個/mL以內(nèi)，每隔30min攪拌1次，防止受精卵相互擠壓影響孵化；72 h后胚胎發(fā)育至D形幼蟲，用280目的篩絹進行選幼。將選出的幼蟲轉移至新桶中進行培育，初始培育密度控制在10個/mL。選幼后開始投喂適量金藻作為開口餌料，本著“少食多餐”的原則每日投喂3～4次，具體投餌量根據(jù)幼蟲密度、生長和攝食情況及時調(diào)整，后期適當加投扁藻和硅藻。幼蟲培育階段持續(xù)微充氣，每天換水70%，每周全量換水1次，每次換水時通過調(diào)整水體大小使各家系培育密度一致。每天顯微鏡觀察幼蟲的攝食、活動情況并按計劃記錄生長大小。

1.3.3 幼蟲的變態(tài)附著 30 d后幼蟲生長到260～280 μm時進入變態(tài)附著階段，當30%幼蟲出現(xiàn)眼點時開始投入1片附著基，后根據(jù)幼蟲密度陸續(xù)投入3～5片附著基。當幼蟲全部附著后繼續(xù)在桶內(nèi)培育1周，并在保苗出庫前5 d進行降溫處理：每次換水時降溫0.5 ℃，直至桶內(nèi)水溫與自然海區(qū)水溫一致。將附著基裝入60目的聚乙烯網(wǎng)袋中并做好標記，轉移到獐子島海區(qū)自然保苗。

1.3.4 海上階段的培育 稚貝轉移到海上保苗后，定期每30 d更換網(wǎng)袋。當稚貝生長到殼長為2 cm時可以轉入養(yǎng)成籠中，每45 d更換養(yǎng)殖籠并記錄生長及剩余個體情況，每次更換網(wǎng)籠時根據(jù)個體大小情況調(diào)整每層個數(shù)并調(diào)整家系間密度一致。

所有實驗、對照組在受精、孵化、幼蟲培育、稚貝保苗及養(yǎng)成階段都嚴格控制在相同的環(huán)境及條件下，以避免人為操作誤差對實驗的影響。

2 實驗結果

2.1 不同近交系數(shù)對受精率和孵化率的影響

表1所示為3組受精率與孵化率的多重比較。從表中可以看出，3個實驗組的受精率都較高且沒有顯著差異，說明受精過程并沒有明顯受到自交的影響。而在孵化率方面，自交組C與其他2組相比明顯降低(P<0.05)，近交組B相比對照組A卻沒有顯著差異。自交組孵化率的衰退也達到了25.91%，說明自交使孵化率產(chǎn)生了較嚴重的衰退。

2.2 幼蟲階段的生長與存活分析

幼蟲階段不同時期生長情況的多重比較見表2。在幼蟲發(fā)育的初期，3組之間幼蟲大小無明顯差異。從第16天開始，2實驗組B、C的幼蟲顯著小于對照組A，并且2個實驗組之間也存在有顯著差異，自交組要小于近交組。從近交衰退率也可以看出，在每個時期自交組C的近交衰退率都顯著高于近交組B，這種差異一直持續(xù)到幼蟲發(fā)育結束(第26天)，并且兩實驗組的近交衰退率都有隨著時間增大的趨勢。

幼蟲時期的存活率見表3。與生長性狀類似，在第6天之前3組的存活率并沒有顯著差異，差異直到幼蟲發(fā)育到第16天才顯示出來，自交組C要顯著低于對照組，而近交組B的均值雖介于自交和對照之間，但與兩者的差異均不顯著。在同一時期，存活率的衰退率(7.32%～42.32%)要遠高于生長性狀(3.50%～13.02%)；并且在存活率性狀中，自交組和近交組的近交衰退率差異要更大，暗示了自交對存活率有更嚴重的影響。

表1 受精率與孵化率的多重比較

注：同一行內(nèi)上標字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)；括號內(nèi)為本組3個平行樣的標準差，下同。

Note:The values with different superscripts within each row are singnificantly different (P>0.05) ; Within parentheses are standard deviation same below.

值得一提的是，在整個幼蟲培育階段，我們并沒有發(fā)現(xiàn)自交或近交對胚胎發(fā)育的進程有明顯的影響，3個實驗組間的胚胎發(fā)育基本是同步的，說明數(shù)據(jù)之間有較高的可比性。

表2 幼蟲大小的多重比較

表3 幼蟲存活率的多重比較

2.3 成體階段近交衰退的表現(xiàn)

成體階段不同時期生長和存活的多重比較見表4。在成體階段，無論在哪個時期的何種性狀，3組之間兩兩都有顯著差異；并且相比于幼蟲時期，成體時期的近交衰退率要更高，暗示了更大的遺傳負荷。自交組的近交衰退率也一直顯著的大于近交組，再次說明不同近交系數(shù)對近交衰退的影響是不同的。

2.4 回歸分析及近交負荷的計算

在3個實驗組中通過不同性狀對近交系數(shù)F的回歸分析可以幫助我們更好的理解衰退的程度。表5所示為不同時期的不同性狀對近交系數(shù)的回歸方程，由于本研究只有3組數(shù)據(jù)，我們僅能利用線性模型。根據(jù)回歸分析的斜率，我們還計算出了不同性狀在不同時期的近交負荷。近交負荷可以直觀的反應出不同性狀衰退的程度。圖1、2分別所示為幼蟲和成體階段生長性狀和存活率的近交負荷變化規(guī)律。不同性狀在不同階段表現(xiàn)出的近交負荷不同，總體來講，死亡率性狀的負荷(0.915～3.277)要明顯高于生長性狀(0.158～0.588)，并且隨著時間的推移，不同性狀的近交負荷都有增大的趨勢。

表4 養(yǎng)成期生長與存活的多重比較

表5 不同性狀對近交系數(shù)的回歸分析

圖1 幼蟲和成體階段生長性狀的近交負荷

圖2 幼蟲和成體階段存活性狀的近交負荷

3 討論

3.1 蝦夷扇貝自交家系與近交衰退的研究

近交衰退研究的動物模型主要集中在傳統(tǒng)模式生物中。近年來，雙殼貝類由于其獨特的繁殖方式(高產(chǎn)卵量，快速發(fā)育的浮游幼蟲及高死亡率)以及多樣的交配系統(tǒng)，已經(jīng)成為研究近交的良好新模式生物。另外，約9%的雙殼貝類中都存在雌雄同體現(xiàn)象[8]，自體受精可以造成嚴重的近交衰退，為研究近交衰退的機理提供了很好的材料。國內(nèi)外已有許多利用雙殼貝類自交系進行近交研究的報道[9-12]。

雖然在雙殼貝類中的近交衰退幾乎都是在雌雄同體物種進行，結果卻不盡相同：如Ibarra等[9]發(fā)現(xiàn)墨西哥灣扇貝(Argopectencircularis)通過自交產(chǎn)生的幼蟲，無論從生長速度還是存活率都要低于雜交；Zheng等[10]在海灣扇貝(Argopectenirradias)中也發(fā)現(xiàn)，近交會使幼蟲和成體的各性狀造成比較嚴重的衰退，且不同的近交系數(shù)對衰退的影響不同。然而并不是所有的性狀都能檢測到衰退，如Beaumont[12]發(fā)現(xiàn)歐洲大扇貝(Pectenmaximus)的近交會使幼蟲的生長速度顯著降低，但并不影響幼蟲的死亡率；而在其他一些雌雄同體的扇貝中，甚至沒有發(fā)現(xiàn)明顯的衰退[11]。究其原因可能是由于不同種群的交配歷史掩蓋了近交衰退的檢測[13]。作為一種雌雄異體生物中的自交系，蝦夷扇貝可以避免由于部分自交帶來的遺傳結構的改變，從而更真實的檢測出近交衰退的規(guī)律。因此是一種研究近交衰退的很好的動物模型。

3.2 蝦夷扇貝中近交衰退表現(xiàn)

本研究通過構建不同近交系數(shù)的家系，研究蝦夷扇貝不同性狀在不同時期的近交衰退。由于選用蝦夷扇貝群體是于2002年引進大連獐子島，經(jīng)過10 a的人工養(yǎng)殖，群體內(nèi)已經(jīng)有了一定程度近交。根據(jù)每代約1 700個個體的有效繁殖群體數(shù)目(Ne)粗略計算(個人統(tǒng)計)，此群體的近交系數(shù)約為2.94×10-4，相比我們采用和自體受精和全同胞交配方式的近交系數(shù)(分別是0.5、0.25)要小的多，并且3種類型的親貝來源于同一群體，相對的近交程度大小受群體自身近交背景影響較小。因此本實驗假定雜交家系的近交系數(shù)為零，做為另2個近交組的對照。

從實驗結果來看，近交對受精率沒有顯著影響，這與其他雌雄同體貝類中的研究結果一致。而自交組孵化率的明顯衰退，這可能是由于自交使有害基因純合過快，孵化過程中又涉及大量的變態(tài)、發(fā)育進程，因此孵化更易受到近交衰退的影響。在幼蟲的生長和存活率方面，近交衰退在幼蟲發(fā)育的前期并沒有表現(xiàn)出來，而從第16天才開始明顯，這可能是由于母體效應在幼蟲發(fā)育的初期影響較大，掩蓋了近交帶來的不利影響；不論是在幼體或成體階段的何種性狀，近交衰退都是隨著時間的推移增大的，近交負荷也呈明顯上升的趨勢，這說明隨著生長，越來越多的效應相對較小的不良基因表現(xiàn)出來。本實驗的研究結果與于瑞海等[7]在探索自交系的構建時發(fā)現(xiàn)的生長性狀沒有沒有明顯衰退有所出入，造成這種差異的主要原因，可能是二者的培育環(huán)境差異較大造成的。已有文獻表明，相對較高的溫度和較好的營養(yǎng)條件會掩蓋近交衰退的檢測[11]，而本實驗是在相對低溫的條件下進行的(大連)，因此更容易檢測到性狀的衰退。

本研究還發(fā)現(xiàn)，近交系數(shù)為0.25的F2組的衰退率要比自交組低，說明不同近交程度對近交衰退的影響是不同的，然而從3組的標準差來看，自交組要明顯高于其他2組，說明相比其他2組，自體交配使不同個體之間的不良基因純化率不同，因此造成個體間性狀較大的差異。另外在同一近交系數(shù)下，2種不同類型性狀的衰退程度也是不同的：在同一時期，存活率的近交負荷幾乎都顯著大于生長性狀。對于不同性狀近交衰退程度不同的原因，Lynch等[14]認為，由于適應性性狀基因位點的突變對生物體而言幾乎都是高度有害的；而相比之下形態(tài)性狀的突變則相對可以接受，即適應性性狀有較高的顯性系數(shù)(Coefficient of dominance)。Roff[15]在蚤螻(Gryllusfirmus)中利用數(shù)學模型證明，與生活史相關的適應性性狀的顯性系數(shù)要明顯高于非適應性性狀。DeRose等[16]對此也給出了3方面的解釋，都認為適應性位點的突變對生物體的危害更大?？傊瑢Υ爽F(xiàn)有的大部分解釋一致認為適應性性狀相比其他性狀有更高的顯性系數(shù)。這一觀點也逐漸被大家接受。

本研究明確表明，近交衰退普遍存在于蝦夷扇貝養(yǎng)殖群體中，但不同的性狀、不同的近交系數(shù)在不同的時期表現(xiàn)是不同的。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)的自交系更低的養(yǎng)成率以及不同家系的衰退差異，暗示著不同遺傳背景下有害等位基因的固定和清除遺傳負荷的發(fā)生。本實驗對近交衰退的研究，有助于我們合理的利用近交或自交加速育種進程，對通過制定合理的育種策略以避免近交對產(chǎn)業(yè)的危害提供了理論基礎。

[1] Charlesworth D, Charlesworth B. Inbreeding depression and its evolutionary consequences [J]. Annual Review of Ecology and Systematic, 1987,18: 237-268.

[2] 張福綏, 李淑英, 開玲欣, 等. 蝦夷扇貝的引種、育苗及試養(yǎng) [J]. 海洋科學, 1984, 1(5): 38-45.

[3] 張明明, 趙文. 我國蝦夷扇貝死亡原因的探討及控制對策 [J]. 中國水產(chǎn), 2008(2): 65-66.

[4] Li Q, Xu K, Yu R. Genetic variation in Chinese hatchery populations of the Japanese scallop (Patinopectenyessoensis) inferred from microsatellite data [J]. Aquaculture, 2007, 269: 211-219.

[5] 丁君, 王婷, 常亞青, 等. 基于AFLP技術的不同群體蝦夷扇貝遺傳結構及多樣性研究 [J]. 煙臺大學學報, 2010(1): 47-53.

[6] 梁峻. 蝦夷扇貝養(yǎng)殖群體數(shù)量性狀遺傳研究 [D]. 青島: 中國科學院研究生院海洋研究所, 2008.

[7] 于瑞海, 王昭萍, 趙雪琳, 等. 蝦夷扇貝雌雄同體自體受精繁殖生物學的研究 [J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2011, 41(11): 23-26.

[8] Heller J. Hermaphroditism in mollusks [J]. Biological Journal of the Linnean Society, 1993, 48(1): 19-42.

[9] Ibarra A M, Cruz P, Romero B A. Effects of inbreeding on growth and survival of self-fertilized catarina scallop(Argopectencircularis) larvae [J]. Aquaculture, 1995, 134(1): 37-47.

[10] Zheng H, Li L, Zhang G. Inbreeding depression for fitness-related traits and purging the genetic load in the hermaphroditic bay scallop (Argopectenirradians)(Mollusca: Bivalvia) [J]. Aquaculture, 2012, 366: 27-33.

[11] Winkler F M, Estévez B F. Effects of self-fertilization on growth and survival of larvae and juveniles of the scallop (ArgopectenpurpuratusL.) [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2003, 292(1): 93-102.

[12] Beaumont A R. Genetic aspects of hatchery rearing of the scallop (PectenmaximusL.) [J]. Aquaculture, 1986, 57(1): 99-110.

[13] Charlesworth D, Morgan M T, Charlesworth B. Inbreeding depression, genetic load, and the evolution of outcrossing rates in a multilocus system with no linkage [J]. Evolution, 1990, 44: 1469-1489.

[14] Lynch M, Walsh B. Genetics and Analysis of Quantitative Traits [M]. Sunderland: Sinauer Associates, MA, 1998.

[15] Roff D A. Effects of inbreeding on morphological and life history traits of the sand cricket,Gryllusfirmus[J]. Heredity, 1998, 81: 28-37.

[16] DeRose M A, Roff D A. A comparison of inbreeding depression in life-history and morphological traits in animals [J]. Evolution, 1999, 53: 1288-1292.

責任編輯 高 蓓

Analysis of Inbreeding Depression inPatinopectenyessoensisBased on Different Inbreeding Coefficient

FU Qiang，WANG Shi，ZHAO Liang，ZHANG Lu， BAO Zhen-Min

(The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding (MGB), Ministry of Education, College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

This article focuses on inbreeding depression on different traits in the life cycle ofPatinopectenyessoensis. Using different mating strategies, we established selfed families with inbreeding coefficient 0.5, F2 families and controlled families respectively. Our study has shown that inbreeding loads of larval growth and survival was 0.158～0.279 and 0.915～1.101. Survival rate suffers more from inbreeding than growth traits. Both traits show an obvious increase with age, which were not significantly different among three groups until 16 days and whose inbreeding loads climbed to 0.348～0.588 and 1.485～3.277 in the adults stage. Our results shows that inbreeding depression is more serious in selfed group with higher inbreeding coefficient than in F2group, and is more severe in survival traits than in growth traits, both of which increased with age.

Patinopectenyessoensis； self-fertilization； inbreeding depression； fitness components； inbreeding loads

國家自然科學基金面上項目(31272656)；留學歸國人員科研啟動金項目(教外司留[2013]1792號)資助

2014-11-21；

2014-12-11

傅 強(1987-)，男，博士，主要從事貝類遺傳育種研究。E-mail：oucfuq@163.com

??通訊作者： E-mail：swang@ouc.edu.cn

P733.2

A

1672-5174(2015)11-043-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20140384