母鼠攝入BPA對(duì)子代AHR mRNA表達(dá)和Th17細(xì)胞的影響

房 魏，李 云，李應(yīng)配，蔣建華，朱啟星，沈 彤，

◇預(yù)防醫(yī)學(xué)研究◇

母鼠攝入BPA對(duì)子代AHR mRNA表達(dá)和Th17細(xì)胞的影響

房 魏1，李 云1，李應(yīng)配1，蔣建華2，朱啟星3，沈 彤1，3

目的研究母鼠圍生期經(jīng)飲水?dāng)z入低劑量雙酚A （BPA）對(duì)子代芳香烴受體（AHR）和輔助性T（Th）17細(xì)胞的影響。方法將確認(rèn)妊娠的ICR母鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組、10、100和1 000 nmol／L BPA組；母鼠自妊娠第0天（GD 0）至仔鼠出生后第21天（PND 21）經(jīng)飲水?dāng)z入BPA。PND 21時(shí)處死仔鼠，取血用ELISA法測血清白細(xì)胞介素（IL）-17和IL-23含量，取脾臟，流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞比例，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt）和AHR mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，各BPA劑量組母鼠孕期體重、仔鼠出生和PND 21時(shí)體重、窩仔數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；100和1 000 nmol／L BPA組仔鼠PND 21時(shí)脾臟Th17細(xì)胞比例均顯著升高（P＜0.05），脾臟RORγt mRNA和AHR mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.01），血清IL-17和IL-23含量也明顯上升（P＜0.01）；脾臟Th17細(xì)胞比例和RORγt mRNA表達(dá)水平與AHR mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)性（P＜0.01）。結(jié)論圍生期母鼠暴露于低劑量BPA可導(dǎo)致子代斷乳時(shí)AHR表達(dá)上調(diào)，并經(jīng)RORγt途徑促進(jìn)Th17細(xì)胞發(fā)育。

雙酚A；芳香烴受體；Th17；免疫發(fā)育毒性

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A（bisphenol A，BPA）是世界范圍內(nèi)大量生產(chǎn)使用的工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于食品飲料包裝、牙科密封劑等塑料制品生產(chǎn)［1］。流行病學(xué)資料［2］提示人類廣泛暴露于環(huán)境BPA污染。生命早期的暴露會(huì)對(duì)出生后機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生長久的影響，如減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的數(shù)量［3－4］。輔助性T（T helper，Th）17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種效應(yīng)T細(xì)胞亞群，其分化依賴于特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體（retinoic acid related orphan receptor，ROR）γt的表達(dá)，主要通過分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17、IL-23、IL-6等炎性細(xì)胞因子而發(fā)揮促炎作用［5］。研究［6－7］表明配體激活轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）以配體依賴的方式調(diào)節(jié)Th0細(xì)胞向Treg或Th17細(xì)胞分化。然而，圍生期BPA暴露對(duì)出生后Th17細(xì)胞和AHR的影響，以及其中Th17細(xì)胞和AHR的關(guān)系目前還不清楚。該研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討母鼠圍生期經(jīng)水?dāng)z入低劑量BPA對(duì)子代斷乳時(shí)Th17細(xì)胞和AHR表達(dá)的影響，并分析兩者之間的關(guān)系，為闡明BPA發(fā)育免疫毒性機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑BPA（99.9%分析純）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司）；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma公司）；藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-anti-CD4抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-anti-IL-17抗體（美國Biolegend公司）；RNA提取純化試劑盒RNeasy Mini Kit（德國QIAGEN公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix、實(shí)時(shí)PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ［寶生物工程（大連）有限公司］；IL-17和IL-23 ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）；Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR儀（美國AB公司）；Universal 320R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（德國Hettich公司）；Elx 800 TM酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理SPF級(jí)ICR 8周齡雌鼠和9周齡雄鼠，購自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食，保持12 h光照／12 h黑暗的晝夜節(jié)律。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，雌∶雄按2∶1合籠，次日清晨查到陰栓定為妊娠第0天（gestational day，GD 0）。孕鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、10、100、1 000 nmol／L BPA組，其中1 000 nmol／L BPA組5只，其余每組均為4只。孕鼠自GD 0至斷乳，即子代出生后第21天（postnatal day，PND 21）經(jīng)飲水暴露BPA。每天記錄母鼠一般情況和飲水量，每周稱重1次。記錄子代出生情況，仔鼠每周稱重1次。PND 21時(shí)，眼球摘除法收集仔鼠外周血，分離血清；處死仔鼠，無菌操作下取脾臟。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測仔鼠脾臟CD4＋T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例取仔鼠脾臟組織約0.3 g，剪碎，200目不銹鋼篩過濾，PBS沖洗制成單細(xì)胞懸液；1 500 r／min離心10 min，棄上清液；臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力大于90%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)；用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整密度至8×107個(gè)／L。取200 μl懸液（約106個(gè)細(xì)胞）加至培養(yǎng)板，加入20 μl莫能菌素（0.1 μg／ml）、50 μl佛波醇乙酯（1 μg／ml）和5 μl離子霉素（50 μg／ml），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，1 500 r／min離心5 min，棄上清液，振蕩均勻；加入0.5 μl PE-anti-CD4，避光靜置10 min行細(xì)胞外染色，加入50 μl固定劑和打孔劑進(jìn)行固定和打孔，再加入1 μl FITC-anti-IL-17避光孵育30 min行細(xì)胞內(nèi)染色，24 h內(nèi)測定Th17細(xì)胞數(shù)量，使用FCS Express V3軟件分析，結(jié)果以Th17細(xì)胞占CD4＋細(xì)胞的比例表示。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）測脾臟RORγt和AHR mRNA表達(dá)水平將新鮮脾臟制成勻漿，用RNeasy Mini Kit試劑盒提取總RNA，PrimeScript?RT Master Mix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR儀上用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：第一步：95℃30 s；第二步（40個(gè)循環(huán)）：95℃變性5 s，60℃退火34 s，擴(kuò)增完成后從60℃開始升溫作熔解曲線驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性。以GAPDH作為內(nèi)參，2－ΔΔCt法分析RORγt、AHR和內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下，RORγt上游引物：5′-CCGCTGAGAGGGCTTCAC-3′，下游引物：5′-TGCAGGAGTAGGCCACATTACA-3′；AHR上游引物：5′-CGCCTCCGGGACGCAGGTGG-3′，下游引物：5′-AAAGAAGCTCTTGGCCCTCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3′，下游引物：5′-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3′。

1.5 ELISA法測定血清IL-17和IL-23含量用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中IL-17和IL-23的含量，按試劑盒說明書操作。酶標(biāo)儀450 nm波長下測吸光度（optical density，OD）值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間的比較采用LSD法，相關(guān)分析用線性Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

表1 飲水?dāng)z入不同劑量BPA母鼠孕期體重（g，±s）

表1 飲水?dāng)z入不同劑量BPA母鼠孕期體重（g，±s）

時(shí)間空白對(duì)照組（n＝4）溶劑對(duì)照組（n＝4）BPA組10 nmol／L（n＝4）100 nmol／L（n＝4）1 000 nmol／L（n＝5）F值P值GD 032.68±2.8631.60±1.2131.78±4.0832.83±2.0031.98±1.720.1880.941 GD 636.13±2.7533.28±2.8734.00±5.2535.10±2.0633.84±1.750.5440.706 GD 1243.23±4.3840.98±2.6642.78±7.2443.08±2.4140.58±4.240.3350.850 GD 1862.40±5.5958.80±3.8464.18±11.3867.05±6.2662.28±10.740.5260.718

表2 BPA暴露母鼠所生子代出生和PND 21時(shí)平均窩仔數(shù)（只，±s）及仔鼠平均體重（g，±s）

表2 BPA暴露母鼠所生子代出生和PND 21時(shí)平均窩仔數(shù)（只，±s）及仔鼠平均體重（g，±s）

時(shí)間項(xiàng)目空白對(duì)照組（n＝4）溶劑對(duì)照組（n＝4）BPA組10 nmol／L（n＝4）100 nmol／L（n＝4）1 000 nmol／L（n＝5）F值P值PND 0窩仔數(shù)13.50±3.1112.25±2.0615.00±4.9715.00±3.3713.40±3.970.4190.793體重1.54±0.131.60±0.111.53±0.091.57±0.241.58±0.100.1940.938 PND 21窩仔數(shù)12.50±2.389.75±2.5011.50±4.2011.25±5.3813.00±3.740.4690.757體重8.86±1.748.89±0.729.41±2.529.04±1.108.99±3.360.0390.997

2.1 一般情況各組母鼠孕期一般情況良好，未出現(xiàn)中毒死亡、流產(chǎn)、死胎和死產(chǎn)現(xiàn)象，不同時(shí)點(diǎn)體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）；子代出生和斷乳時(shí)，各組仔鼠平均窩仔數(shù)及平均體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.2 母鼠飲水?dāng)z入BPA對(duì)仔鼠PND 21時(shí)脾臟Th17細(xì)胞數(shù)量影響用PE-anti-CD4和FITC-anti-IL-17抗體標(biāo)記仔鼠PND 21時(shí)脾臟細(xì)胞懸液，F(xiàn)CM檢測Th17細(xì)胞數(shù)量，見圖1?？瞻讓?duì)照組與溶劑對(duì)照組比較，仔鼠脾臟Th17數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仔鼠脾臟Th17細(xì)胞比例隨母鼠BPA暴露劑量的增加而升高；與空白對(duì)照組比較，100、1 000 nmol／L BPA組仔鼠脾臟Th17細(xì)胞比例升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

2.3 母鼠飲水?dāng)z入BPA對(duì)仔鼠PND 21時(shí)脾臟RORγt mRNA表達(dá)水平影響空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組比較，仔鼠脾臟RORγt mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仔鼠脾臟RORγt mRNA表達(dá)水平隨母鼠BPA暴露劑量的增加而上調(diào)；與空白對(duì)照組比較，100、1 000 nmol／L BPA組仔鼠脾臟RORγt mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。見表3。

2.4 母鼠飲水?dāng)z入BPA對(duì)仔鼠PND 21時(shí)血清IL-17和IL-23含量影響空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組仔鼠血清IL-17和IL-23含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；仔鼠血清IL-17和IL-23含量均隨母鼠BPA暴露劑量的增加而升高，100、1 000 nmol／L BPA組仔鼠血清IL-17和IL-23含量明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。見表4。

表3 母鼠圍生期BPA暴露對(duì)子代PND 21時(shí)脾臟Th17細(xì)胞比例（%）和RORγt mRNA表達(dá)的影響

表4 母鼠圍生期暴露BPA對(duì)仔鼠PND 21時(shí)血清IL-17和IL-23含量影響（pg／ml，n＝6）

2.5 母鼠圍生期飲水?dāng)z入BPA對(duì)仔鼠PND21脾臟AHR影響各組AHR mRNA表達(dá)水平分別為：空白對(duì)照組（1.30±0.07），溶劑對(duì)照組（1.32± 0.07），10 nmol／L BPA組（1.41±0.06），100 nmol／L BPA組（1.63±0.09），1 000 nmol／L BPA組（1.81±0.07）?？瞻讓?duì)照組與溶劑對(duì)照組比較，子代脾臟AHR mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AHR mRNA表達(dá)水平隨母鼠BPA暴露劑量的增加而上調(diào)，與空白對(duì)照組比較，10 nmol／L BPA組AHR mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），100 nmol／L BPA組和1 000 nmol／L BPA組AHR mRNA表達(dá)差異更顯著（P＜0.01）。

2.6 仔鼠脾臟Th17細(xì)胞比例和RORγt mRNA表達(dá)水平與AHR mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性仔鼠脾臟Th17細(xì)胞比例與AHR mRNA表達(dá)水平作相關(guān)分析，顯示兩者呈正相關(guān)性且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.975，P＜0.01）；RORγt mRNA表達(dá)水平與AHR mRNA表達(dá)水平作相關(guān)分析，兩者也呈正相關(guān)性且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.998，P＜0.01）。

3 討論

環(huán)境BPA暴露主要通過消化道和皮膚接觸等途徑，本研究母鼠暴露BPA采用飲水?dāng)z入的方式，與人類暴露途徑類似。BPA具有弱的雌激素作用，研究［3］顯示環(huán)境相當(dāng)劑量BPA暴露可對(duì)機(jī)體生殖、神經(jīng)、代謝和內(nèi)分泌等系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，本研究中母鼠BPA暴露的最高劑量為1 000 nmol／L，按照母鼠每天飲水量5～10 ml計(jì)算，每天BPA攝入量最高為45.6 μg／kg，仍低于美國環(huán)保署（EPA）規(guī)定的參考劑量50 μg。

研究［8］表明出生前BPA暴露可引起機(jī)體免疫功能改變，如引起Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子減少和Treg數(shù)量下降等。Th17細(xì)胞主要通過分泌IL-17等參與炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤等的發(fā)生和發(fā)展［5］。Treg與Th17細(xì)胞的平衡在維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［9］。本研究表明母鼠圍生期低劑量BPA暴露可促進(jìn)子代出生后Th17細(xì)胞的發(fā)育和功能改變。

RORγt是Th17細(xì)胞特征性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，不僅在Th17細(xì)胞的分化發(fā)育中起著調(diào)控作用，還在Th17細(xì)胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］。本研究RT-qPCR檢測結(jié)果顯示母鼠圍生期BPA暴露可能上調(diào)子代RORγt的表達(dá)，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化發(fā)育和功能發(fā)揮。

AHR是細(xì)胞內(nèi)一類重要的外源化學(xué)物受體和配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，與配體結(jié)合后可誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。研究［6］顯示，AHR還調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化發(fā)育。本研究顯示仔鼠脾臟AHR mRNA隨母鼠BPA攝入劑量的增加而上調(diào)，提示母鼠圍生期環(huán)境低劑量BPA暴露可上調(diào)子代AHR的表達(dá)。這與研究［10］結(jié)果一致。相關(guān)分析顯示仔鼠脾臟AHR mRNA表達(dá)水平與Th17細(xì)胞比例和RORγt mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)性，提示母鼠BPA暴露所致子代AHR表達(dá)上調(diào)可能在其導(dǎo)致子代Th17細(xì)胞比例增加和RORγt表達(dá)上調(diào)中起著調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，母鼠圍生期飲水?dāng)z入低劑量BPA可能通過上調(diào)AHR表達(dá)、調(diào)控RORγt表達(dá)增加、促進(jìn)仔鼠出生后Th17細(xì)胞的分化發(fā)育，從而影響仔鼠免疫功能。該結(jié)果為環(huán)境BPA暴露免疫發(fā)育毒性機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)資料，至于母鼠暴露低劑量BPA誘導(dǎo)AHR上調(diào)、調(diào)控RORγt表達(dá)和Th17細(xì)胞分化發(fā)育的具體分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

［1］ Huang Y Q，Wong C K，Zheng J S，et al.Bisphenol A（BPA）in China：a review of sources，environmental levels，and potential human health impacts［J］.Environ Int，2012，42：91－9.

［2］ Vandenberg L N，Chahoud I，Heindel J J，et al.Urinary，circulating，and tissue biomonitoring studies indicate widespread exposure to bisphenol A［J］.Environ Health Perspect，2010，118 （8）：1055－70.

［3］ Rochester J R.Bisphenol A and human health：A review of the literature［J］.Reprod Toxicol，2013，42：132－55.

［4］ 丁宋軍，李 云，房 魏，等.圍生期高劑量雙酚A暴露對(duì)仔鼠生命早期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（1）：26－9.

［5］ Miossec P，Korn T，Kuchroo V K.Interleukin-17 and type 17 helper T cells［J］.N Engl J Med，2009，361（9）：888－98.

［6］ Hayes M D，Ovcinnikovs V，Smith A G，et al.The aryl hydrocarbon receptor：differential contribution to T helper 17 and T cytotoxic 17 cell development［J］.PLoS One，2014，9（9）：e106955.

［7］ Quintana F J，Basso A S，Iglesias A H，et al.Control of T（reg）and T（H）17 cell differentiation by the aryl hydrocarbon receptor ［J］.Nature，2008，453（7191）：65－71.

［8］ Yan H，Takamoto M，Sugane K.Exposure to Bisphenol A prenatally or in adulthood promotes TH2 cytokine production associated with reduction of CD4CD25 regulatory T cells［J］.Environ Health Perspect，2008，116（4）：514－9.

［9］ Littman D R，Rudensky A Y.Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation［J］.Cell，2010，140（6）：845－58.

［10］Nishizawa H，Morita M，Sugimoto M，et al.Effects of in utero exposure to bisphenol A on mRNA expression of arylhydrocarbon and retinoid receptors in murine embryos［J］.J Reprod Dev，2005，51（3）：315－24.

Effects of perinatal maternal exposed to BPA on AHR mRNA expression and Th17 cell of offspring mice

Fang Wei，Li Yun，Li Yingpei，et al
（Dept of Health Toxicology，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveThe present study was to investigate the effects of low－dose bisphenol A（BPA）exposure by drinking water during perinatal period on aryl hydrocarbon receptor（AHR）and Th17 cells in its offspring.MethodsThe pregnant ICR mice were randomly divided into 5 groups：blank control，vehicle control，10，100 and 1 000 nmol／L BPA groups and exposed to BPA by drinking water from gestational day 0（GD 0）to postnatal day 21（PND 21）.Fetuses were sacrificed on PND 21.The levels of IL-17 and IL-23 in serum were detected by ELISA，and the proportion of Th17 cells in spleen was measured by flow cytometry.RT-qPCR was conducted to detect the mRNA levels of RORγt and AHR in spleen.ResultsAs compared to the control group，the maternal body weight during pregnancy，fetal body weight at birth and PND 21，the number of fetuses per litter，were all found of no significant difference in BPA groups.In fetuses at PND 21 in 100 and 1 000 nmol／L BPA groups，the proportion of Th17 cells in spleen was significantly increased（P＜0.05）；the mRNA levels of RORγt and AHR were markedly raised（P＜0.01）；meanwhile，serum IL-17 and IL-23 were significantly increased（P＜0.01），compared with the control.A positive correlation was observed between the proportion of Th17 cells and the mRNA levels of RORγt，AHR（P＜0.01）.ConclusionPerinatal exposure of BPA at a low dose can increase the level of AHR，and promote the differentiation of Th17 cells through RORγt in offspring after weaning.

bisphenol A；AHR；Th17；developmental immunotoxicity

R 114；R 994.6

A

1000－1492（2015）07－0958－05

2015－03－31接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81473015）

安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院1衛(wèi)生毒理學(xué)系、3職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，合肥 230022

房 魏，男，碩士研究生；沈 彤，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ahmusht＠163.com