6齡黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)受球孢白僵菌侵染后生長(zhǎng)發(fā)育及體內(nèi)成瘤反應(yīng)的變化

李平 江幸福 孟令賀 程云霞 張蕾 翟保平

摘要 為探討?zhàn)はx(chóng)被球孢白僵菌侵染后生長(zhǎng)發(fā)育情況及其體內(nèi)的免疫反應(yīng)，設(shè)置孢子濃度為104、5×104、105、5×105、106個(gè)/mL及5×106個(gè)/mL的球孢白僵菌菌液注射黏蟲(chóng)6齡初幼蟲(chóng)，研究球孢白僵菌對(duì)黏蟲(chóng)校正死亡率、羽化率、蛹重等生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的影響以及成瘤反應(yīng)的濃度依賴效應(yīng)。結(jié)果表明，6齡幼蟲(chóng)的校正死亡率隨菌液濃度升高而逐漸增加。蛹重隨菌液濃度增加而下降，但僅在106、5×106個(gè)/mL濃度處理時(shí)蛹重顯著低于對(duì)照。同時(shí)，在孢子濃度為5×105、106、5×106個(gè)/mL時(shí)羽化率較對(duì)照顯著降低，雌雄成蟲(chóng)壽命也顯著縮短，而6齡幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)羽化的發(fā)育歷期在105、5×105、106、5×106個(gè)/mL濃度處理時(shí)較對(duì)照顯著延長(zhǎng)。此外，白僵菌侵染誘發(fā)黏蟲(chóng)免疫成瘤反應(yīng)，并且具有明顯的時(shí)間和濃度效應(yīng)。注射84 h內(nèi)，黏蟲(chóng)體內(nèi)成瘤的數(shù)量隨注射時(shí)間延長(zhǎng)而遞增，其后不再增加;同時(shí)，成瘤數(shù)量隨著菌液濃度升高而增加，至106個(gè)/mL濃度時(shí)不再顯著上升。該結(jié)果為揭示黏蟲(chóng)抵抗真菌侵染的免疫防御機(jī)制以及所產(chǎn)生的免疫代價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黏蟲(chóng); 白僵菌; 生長(zhǎng)發(fā)育; 成瘤

中圖分類號(hào)： S 433.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020560

Changes in the development and nodule formation of the 6th-instar

Mythimna separata larvae after infection by Beauveria bassiana

LI Ping1，2， JIANG Xingfu2， MENG Linghe2， CHENG Yunxia2， ZHANG Lei2*， ZHAI Baoping1*

（1. College of Plant Protection，Key Laboratory of Integrated Management of Crop Disease and Pests，Ministry of

Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095， China;? 2. State Key Laboratory for Biology of Plant

Disease and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，China）

Abstract

In order to explore the effects of Beauveria bassiana on the growth and development of Mythimna separata and its induction of immune response， the spore concentration was set to 104， 5×104， 105， 5×105， 106 and 5×106 spores/mL， respectively. The 6th-instar larvae of M.separata were injected with Beauveria bassiana spore suspensions to study the effects of B.bassiana on the growth and developmental indicators such as corrected mortality， emergence rate， pupa weight， and the injection concentration-dependent effect of nodule formation. The results showed that the corrected mortality of the 6th-instar larvae increased with increasing injection concentration. Pupa weight decreased with increasing injection concentration， but decreased significantly at the concentrations of 106 and 5×106 spores/mL. At the same time， the emergency rate decreased significantly with the increase of treatment concentration only under the concentration of 5×105， 106， 5×106 spores/mL. The life spans of male and female adults were also significantly shortened. The developmental duration from the 6th-instar larvae to emergency was significantly longer than that of the control at the concentration of 105 spores/mL and above. In addition， infection by B.bassiana induced immune responses of M.separata with significant time and concentration effects. Within 84 h after injection， the number of nodules increased with time， but did not increase significantly thereafter. In addition， the number of nodules increased with increasing fungal liquid concentration， but the number of nodules did not increase significantly when the concentration reached 106 spores/mL. The results provide a scientific basis for revealing the immune defense mechanism of M.separata against fungal infection and immune cost.

Key words

Mythimna separata; Beauveria bassiana; development; nodule formation

病原真菌進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)會(huì)受到寄主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和抵抗[1-2]。昆蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)是一個(gè)完整地存在于開(kāi)放血淋巴系統(tǒng)的防御體系，通常由血漿中抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶等活性因子參與的體液免疫系統(tǒng)以及多種功能的血細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫系統(tǒng)組成[3-4]。其中昆蟲(chóng)的細(xì)胞免疫主要依賴血細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原或異物的吞噬、集結(jié)和包囊作用，所以昆蟲(chóng)體內(nèi)血細(xì)胞的數(shù)量、微聚成瘤等反應(yīng)可作為判斷昆蟲(chóng)免疫力的主要指標(biāo)[5-7]。細(xì)菌、病毒和真菌都可以有效誘導(dǎo)昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)，而注射孢子或分生孢子是實(shí)驗(yàn)室研究中真菌感染昆蟲(chóng)的常用手段[8]，例如Shamakhi通過(guò)注射球孢白僵菌Beauveria bassiana證實(shí)了在不同溫度脅迫條件下二化螟Chilo suppressalis免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在短時(shí)間內(nèi)[9];注射轉(zhuǎn)錄因子MaSom1缺失的蝗綠僵菌孢子后，蝗蟲(chóng)的免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)，體壁內(nèi)側(cè)成瘤數(shù)增加[10];黑腹果蠅Drosophila melanogaster免疫的性別二態(tài)性并不完全表現(xiàn)在表皮防御方面，注射接種和表面噴霧接種球孢白僵菌時(shí)雄蟲(chóng)的防御均強(qiáng)于雌蟲(chóng)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，寄生物可能對(duì)宿主的生活史進(jìn)化、性選擇和種群動(dòng)態(tài)產(chǎn)生影響，而昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)的維持和免疫反應(yīng)的完成需要消耗大量的能量，所以宿主往往會(huì)做出適應(yīng)與權(quán)衡，利用繁殖的資源以防止寄生物的感染及其隨后的增殖[12]。在免疫系統(tǒng)上能量的投入會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)在免疫脅迫下生存的整體健康狀況下降，體現(xiàn)為昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育受損、繁殖能力的下降、存活率降低、壽命縮短，甚至第二性征發(fā)育受到抑制[13-16]。

球孢白僵菌 Beauveria bassiana具有容易培養(yǎng)、致病力強(qiáng)、廣譜以及對(duì)溫血?jiǎng)游锖椭参餆o(wú)害的特點(diǎn)，是目前世界上研究和應(yīng)用最多的蟲(chóng)生真菌之一[17]?？杉纳?5個(gè)目149個(gè)科的700多種昆蟲(chóng)及蜱螨類，是田間及野外最常見(jiàn)的致病真菌，同時(shí)被認(rèn)為是防治蛾類的最佳選擇[18-19]。球孢白僵菌已經(jīng)廣泛運(yùn)用于煙粉虱Bemisia tabaci、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis等農(nóng)林害蟲(chóng)的防治[20-21]。研究病原真菌與害蟲(chóng)的互作關(guān)系對(duì)昆蟲(chóng)病原真菌的田間實(shí)際應(yīng)用有重要意義。目前關(guān)于白僵菌誘導(dǎo)昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫的研究多是關(guān)于血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量、類型變化及包囊作用，研究發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼蟲(chóng)、蔥蠅Delia antiqua成蟲(chóng)、亞洲玉米螟幼蟲(chóng)對(duì)球孢白僵菌孢子的侵入均產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞防御，血細(xì)胞能夠一定程度上抑制菌絲增殖[22-24]。

黏蟲(chóng)Mythimna separata是一種典型的遠(yuǎn)距離遷飛害蟲(chóng)，可取食玉米、小麥、水稻等多種禾谷類糧食作物，還可為害棉花與蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物，其飛行能力強(qiáng)、發(fā)生范圍廣、為害世代多，每年在我國(guó)南北地區(qū)有4～5次大范圍的往返遷飛為害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失，除新疆外，其他地區(qū)均發(fā)現(xiàn)黏蟲(chóng)為害[25-26]。近年來(lái)，隨著氣候變化以及種植結(jié)構(gòu)的改變，黏蟲(chóng)適應(yīng)能力更強(qiáng)，在我國(guó)的發(fā)生為害呈現(xiàn)出新的特點(diǎn)[27]。目前有關(guān)白僵菌防治黏蟲(chóng)的研究報(bào)道較少，防御機(jī)制的研究多針對(duì)黏蟲(chóng)體內(nèi)相關(guān)保護(hù)酶的變化，如黏蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)被球孢白僵菌Bb314侵染初期，可通過(guò)增強(qiáng)保護(hù)酶和解毒酶的活性來(lái)維持蟲(chóng)體的正常生理功能[28]。關(guān)于白僵菌誘發(fā)的黏蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞免疫反應(yīng)以及侵染對(duì)黏蟲(chóng)后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育影響的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以白僵菌這種田間主要生防菌作為免疫誘導(dǎo)物，用不同濃度的菌液注射黏蟲(chóng)確保其受到不同強(qiáng)度的免疫刺激，探究對(duì)其后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育和體內(nèi)成瘤反應(yīng)的影響，旨在更全面地了解真菌誘導(dǎo)的昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)機(jī)制以及昆蟲(chóng)免疫防御代價(jià)，為研制高效的真菌殺蟲(chóng)劑、指導(dǎo)白僵菌的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源及菌株

試驗(yàn)用黏蟲(chóng)采自吉林省四平市公主嶺市田間，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁殖飼養(yǎng)多代。幼蟲(chóng)用新鮮玉米苗飼養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為（24±1）℃，相對(duì)濕度設(shè)置為70%左右，光周期L∥D=14 h∥10 h，密度設(shè)置為10頭/瓶（9 cm×13 cm）。

試驗(yàn)所用球孢白僵菌GZGY-1-3由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜害蟲(chóng)研究組提供。用SDA 培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行活化。在（25±2）℃下培養(yǎng)7～10 d后用0.05%吐溫-80無(wú)菌水沖洗平板獲取孢子，過(guò)濾離心再懸浮進(jìn)行清洗，最終獲取新鮮孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)法（25×16個(gè)方格）測(cè)定孢子濃度。最終配制成濃度為104、5×104、105、5×105、106、5×106、107個(gè)/mL及108個(gè)/mL的孢子懸浮液，用于注射接種。對(duì)照組注射含0.05% 吐溫-80的無(wú)菌水。

孢子懸浮液濃度=（80個(gè)方格內(nèi)總孢子數(shù)/80）×4×106×懸浮液稀釋倍數(shù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 注射法接種球孢白僵菌

選擇6齡蛻皮后24 h內(nèi)的幼蟲(chóng)進(jìn)行注射。在注射之前，將幼蟲(chóng)在冰上放置30 min麻醉，并使用70%乙醇對(duì)穿刺部位周?chē)谋砥みM(jìn)行消毒。使用5 μL的注射器（30號(hào)針頭）（Hamilton，瑞士）吸取1 μL新鮮配制的孢子懸浮液通過(guò)幼蟲(chóng)第3腹足與腹部的連接處表皮注射入幼蟲(chóng)體內(nèi)，注射過(guò)程中要避免刺破中腸。選取出血量很少且生命體征明顯的幼蟲(chóng)進(jìn)行后續(xù)觀察。對(duì)照組注射1 μL含0.05%吐溫-80的無(wú)菌水。

1.2.2 不同濃度球孢白僵菌免疫誘導(dǎo)對(duì)黏蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

6齡幼蟲(chóng)經(jīng)不同濃度球孢白僵菌注射處理后，繼續(xù)在10頭/瓶的密度條件下采用新鮮玉米苗飼喂，每30頭為一組，3個(gè)重復(fù)，每天觀察記錄幼蟲(chóng)死亡日期。幼蟲(chóng)老熟時(shí)，加入含水量10%左右的土壤供其化蛹，并記錄成蟲(chóng)羽化日期及死亡日期，幼蟲(chóng)化蛹3 d后用萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO、美國(guó)）稱量蛹重。計(jì)算幼蟲(chóng)死亡率、校正死亡率（成功化蛹前感染死亡數(shù)與6齡初處理數(shù)對(duì)比）、羽化率以及LC50。

校正死亡率=（處理死亡率-對(duì)照死亡率）/（1-對(duì)照死亡率）×100%;

羽化率=羽化數(shù)/成功化蛹數(shù)×100%。

1.2.3 成瘤的計(jì)數(shù)方法

首先將幼蟲(chóng)放在冰面上30 min進(jìn)行麻醉，然后用解剖剪將幼蟲(chóng)腹部表皮從頭到尾剪開(kāi)，使用昆蟲(chóng)針展開(kāi)固定在黑色蠟盤(pán)上，用PBS緩沖液輕輕洗滌內(nèi)表面幾次，去除可能被誤認(rèn)為結(jié)節(jié)的污染物。檢查消化道表面有無(wú)結(jié)節(jié)，之后取出丟棄。用體視鏡（Olympus，日本）觀察拍攝幼蟲(chóng)內(nèi)表面結(jié)瘤數(shù)。由于個(gè)體產(chǎn)生的結(jié)瘤大小存在明顯的差異，根據(jù)Zhang等[29]的解剖計(jì)數(shù)方法對(duì)瘤的大小進(jìn)行測(cè)量時(shí)，每30 μm長(zhǎng)作為一個(gè)單位IN（indexed nodule），不足30 μm記為一個(gè)IN。數(shù)據(jù)結(jié)果記錄為IN/頭。

1.2.4 成瘤反應(yīng)的時(shí)間動(dòng)態(tài)的測(cè)定

根據(jù)注射不同濃度球孢白僵菌后黏蟲(chóng)的校正死亡率，選取106個(gè)/mL球孢白僵菌孢子懸浮液對(duì)幼蟲(chóng)進(jìn)行注射侵染，分別在注射后0、6、12、24、48、72、84、96 h時(shí)進(jìn)行解剖觀察其成瘤反應(yīng)。每組11頭幼蟲(chóng)。

1.2.5 不同濃度球孢白僵菌免疫誘導(dǎo)下的成瘤反應(yīng)

取1 μL不同濃度（104、5×104、105、5×105、106、5×106個(gè)/mL）孢子懸浮液注射幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)處理方法和注射方法同前。根據(jù)1.2.4時(shí)間動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果，選取成瘤不再增加的時(shí)間對(duì)處理過(guò)的幼蟲(chóng)進(jìn)行解剖拍照，計(jì)算成瘤數(shù)量。對(duì)照組注射相同體積的含0.05%吐溫-80的無(wú)菌水。每組10頭幼蟲(chóng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 24.0進(jìn)行方差分析。對(duì)于死亡率和羽化率等涉及百分率的數(shù)據(jù)先進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換。采用單因素方差分析（ANOVA）和LSD檢驗(yàn)比較不同濃度組別間的差異顯著性（P<0.05），所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌侵染對(duì)黏蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，注射吐溫-80后黏蟲(chóng)死亡率與不做任何處理的相比不存在顯著差異（|t|1，2=0500，P=0.667），故后續(xù)試驗(yàn)不再設(shè)置空白對(duì)照，均以注射吐溫-80的處理作為對(duì)照組。由表1可以看出注射不同濃度球孢白僵菌孢子懸浮液對(duì)6齡黏蟲(chóng)的死亡率及校正死亡率具有顯著影響（F8，18=477.983，P<0001;F7，16=111.125，P<0.001），表現(xiàn)為隨著注射濃度的增加，處理后黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率與校正死亡率均隨之增加。但在104～105個(gè)/mL相對(duì)較低的濃度下，黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的校正死亡率沒(méi)有顯著差異（P>0.05），當(dāng)孢子懸浮液濃度達(dá)到106個(gè)/mL時(shí)黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的校正死亡率相比低濃度處理顯著增加（P<0001）。107個(gè)/mL處理下校正死亡率達(dá)到7407%。最高濃度（108個(gè)/mL）下幼蟲(chóng)全部死亡，根據(jù)校正死亡率得到毒力回歸方程y=-1.050+0876x （χ2=155.180，df=6，P<0.001），計(jì)算出LC50=8.03×106個(gè)/mL。由于107個(gè)/mL及108個(gè)/mL濃度下幼蟲(chóng)死亡率過(guò)高，后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定不再設(shè)置此濃度。選擇104、5×104、105、5×105、106個(gè)/mL及5×106個(gè)/mL作為后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育及成瘤反應(yīng)試驗(yàn)的濃度。

球孢白僵菌注射處理對(duì)黏蟲(chóng)化蛹后的蛹重有顯著影響（F6，505=5.986，P<0.001，圖1）。但僅在高濃度，106個(gè)/mL及5×106個(gè)/mL下表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)，蛹重減少至311.31 mg和300.63 mg，顯著低于注射吐溫-80的對(duì)照組32911 mg（P<005），但這兩個(gè)濃度之間不存在顯著差異（P>005）。而相對(duì)較低濃度的真菌侵染并不影響?zhàn)はx(chóng)蛹的發(fā)育，體現(xiàn)在104～5×105個(gè)/mL濃度處理的黏蟲(chóng)蛹重與對(duì)照以及各組之間均無(wú)顯著差異（P>0.05）。

球孢白僵菌侵染對(duì)黏蟲(chóng)的羽化也具有顯著抑制作用（F6，14=23.406，P<0.001），隨著菌液濃度的升高黏蟲(chóng)的羽化率表現(xiàn)出明顯下降的趨勢(shì)（圖2）。對(duì)照組以及104～105個(gè)/mL濃度處理之間均無(wú)顯著差異（P>0.05），而5×105～5×106個(gè)/mL處理黏蟲(chóng)羽化率較對(duì)照組及其他低濃度處理顯著降低（P<0.05），其中最高濃度5×106個(gè)/mL處理的羽化率由對(duì)照組最高93.83%降至59.07%，降低了1/3左右。

不同濃度球孢白僵菌侵染后6齡幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)羽化的發(fā)育歷期有顯著差異（F6，423=46.524，P<0001，圖3）。黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)羽化的發(fā)育歷期隨濃度的升高而逐漸延長(zhǎng)，105～5×106個(gè)/mL處理的發(fā)育歷期較對(duì)照組均顯著延長(zhǎng)（P<0.05），其中5×106個(gè)/mL處理的歷期最長(zhǎng)，達(dá)19.98 d，較對(duì)照組（18.07 d）延長(zhǎng)近2 d。106個(gè)/mL與5×106個(gè)/mL兩個(gè)高濃度處理的歷期無(wú)顯著差異（P>005），但較低濃度處理均顯著延長(zhǎng)（P<0.05）。

球孢白僵菌侵染對(duì)黏蟲(chóng)雌、雄成蟲(chóng)的壽命均有顯著影響（雌F6，124=6.253，P<0.001;雄F6，124=2862，P=0.012）（圖4）。孢子懸浮液濃度的提高顯著抑制了成蟲(chóng)的正常發(fā)育，縮短了成蟲(chóng)的

壽命。5×105～5×106個(gè)/mL濃度處理后雌、雄蟲(chóng)的壽命均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），其中最高濃

度（5×106個(gè)/mL）的處理組，雌蟲(chóng)壽命8.09 d，較對(duì)照縮短近1/3;而雄蟲(chóng)的壽命為11 d較對(duì)照組縮短近1/4。

2.2 成瘤反應(yīng)的時(shí)間動(dòng)態(tài)及形態(tài)變化

選取對(duì)黏蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育有顯著抑制作用但致死率不是太高的106個(gè)/mL孢子懸浮液注射黏蟲(chóng)。

圖5為黏蟲(chóng)體內(nèi)結(jié)瘤形態(tài)隨時(shí)間推移發(fā)生的變化。注射后6 h黏蟲(chóng)體內(nèi)形成小黑點(diǎn)狀結(jié)瘤，數(shù)量少，多附著在葉狀脂肪體邊緣，邊界清晰（圖5a），且體積通常不超過(guò)2 IN。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，結(jié)瘤數(shù)量逐漸增多，且體積變大，多在2～3 IN，并且開(kāi)始出現(xiàn)以團(tuán)狀結(jié)瘤為中心，外圍褐色散點(diǎn)分布的較大的結(jié)瘤團(tuán)（圖5b）。將結(jié)瘤團(tuán)放大觀察，可以看到褐色的結(jié)瘤被白色透明狀的膠質(zhì)層包裹，周?chē)⒉嫉男⌒徒Y(jié)瘤呈衛(wèi)星狀環(huán)繞（圖5c）。隨后出現(xiàn)凝聚成團(tuán)的結(jié)瘤，但邊緣不規(guī)則且顏色較中間部分淺淡（圖5d）。72 h時(shí)在黏蟲(chóng)氣孔附近出現(xiàn)大量散點(diǎn)狀結(jié)瘤團(tuán)，且邊緣模糊顏色呈黃褐色，膠質(zhì)團(tuán)出現(xiàn)不規(guī)則的形狀且相互連接（圖5e）。84 h后小型的結(jié)瘤幾乎消失，而這些散點(diǎn)結(jié)瘤凝聚成大的團(tuán)狀黑瘤散布在氣管周?chē)▓D5f），且形態(tài)不再變化，趨于穩(wěn)定。

圖6可看出，隨時(shí)間增加黏蟲(chóng)體內(nèi)成瘤數(shù)量隨之遞增。注射后即刻解剖（0 h）作為對(duì)照，結(jié)瘤數(shù)量?jī)H有6.18 IN/頭，此時(shí)黏蟲(chóng)體內(nèi)還未發(fā)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，其免疫響應(yīng)需要一定的時(shí)間，在注射6 h后黏蟲(chóng)體內(nèi)結(jié)瘤數(shù)量增加為32.64 IN/頭。在6～12 h時(shí)間段內(nèi)黏蟲(chóng)成瘤數(shù)量顯著提升（F7，80=151942，P<0.001），隨后放緩。在注射后24 h至84 h內(nèi)的幾個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，黏蟲(chóng)體內(nèi)的結(jié)瘤數(shù)量顯著增加。而在處理84 h后黏蟲(chóng)體內(nèi)的結(jié)瘤數(shù)量不再大幅增加，趨于平穩(wěn)，與96 h的數(shù)量無(wú)顯著差異（P>0.05）。

2.3 不同濃度球孢白僵菌侵染后黏蟲(chóng)成瘤反應(yīng)的變化

根據(jù)前面成瘤反應(yīng)時(shí)間動(dòng)態(tài)的結(jié)果，選擇在注射處理后84 h進(jìn)行解剖，觀察測(cè)量不同濃度間黏蟲(chóng)體內(nèi)結(jié)瘤數(shù)量的差異?？梢钥闯觯S著菌液濃度的升高，黏蟲(chóng)體內(nèi)結(jié)瘤數(shù)量隨之增加（F6，63=133988，P<0.001，圖7）。其中，注射濃度5×104～106個(gè)/mL時(shí)，結(jié)瘤數(shù)隨著注射濃度的增加而顯著上升，但至106個(gè)/mL濃度后不再顯著增長(zhǎng)（P>0.05）。

3 討論

昆蟲(chóng)在受到外界寄生物侵染時(shí)，會(huì)迅速產(chǎn)生免疫反應(yīng)來(lái)做出響應(yīng)，在昆蟲(chóng)對(duì)真菌感染的免疫防御中，細(xì)胞免疫中的包囊作用和形成結(jié)瘤并黑化的過(guò)程常體現(xiàn)為昆蟲(chóng)的免疫防御反應(yīng)。昆蟲(chóng)主要是通過(guò)在自身和寄生物之間形成物理屏障來(lái)限制入侵生物造成損害[30-32]。成瘤反應(yīng)也被證實(shí)廣泛存在于昆蟲(chóng)中，對(duì)昆蟲(chóng)的生存具有重要的意義，同時(shí)常被用于昆蟲(chóng)免疫能力的評(píng)估。在進(jìn)行細(xì)胞免疫相關(guān)試驗(yàn)時(shí)通常通過(guò)注射接種直接刺激血腔誘導(dǎo)成瘤反應(yīng)，這樣可以在確保試蟲(chóng)受到感染的同時(shí)對(duì)蟲(chóng)體內(nèi)的感染物定量[33-34]。為了便于解剖和觀察黏蟲(chóng)受到真菌侵染后血腔內(nèi)的細(xì)胞免疫現(xiàn)象，本試驗(yàn)選取黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)作為試驗(yàn)對(duì)象并以結(jié)瘤數(shù)量作為指標(biāo)，試驗(yàn)證明了球孢白僵菌侵染會(huì)誘導(dǎo)黏蟲(chóng)體內(nèi)的成瘤反應(yīng)，且無(wú)論注射的孢子懸浮液濃度高還是低，黏蟲(chóng)體內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)來(lái)抵御外來(lái)病原物的侵染。昆蟲(chóng)種類不同或同一物種內(nèi)的血細(xì)胞數(shù)量不同，結(jié)瘤的數(shù)量上限也不同[35]，這種限制體現(xiàn)在結(jié)瘤反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程和注射真菌孢子數(shù)量對(duì)總結(jié)瘤數(shù)量的影響。黏蟲(chóng)體內(nèi)的結(jié)瘤數(shù)量在注射球孢白僵菌孢子后開(kāi)始增加，到84 h時(shí)數(shù)量穩(wěn)定，不再增長(zhǎng)，且在注射濃度達(dá)到106個(gè)/mL時(shí)黏蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生的結(jié)瘤數(shù)量也不再顯著增加。同時(shí)，在104～5×106個(gè)/mL濃度范圍內(nèi)感染強(qiáng)度越大結(jié)瘤數(shù)量越多，幼蟲(chóng)死亡率也越高，幸存?zhèn)€體的生長(zhǎng)發(fā)育也受到影響。這說(shuō)明成瘤反應(yīng)所代表的黏蟲(chóng)體內(nèi)免疫反應(yīng)是其生存必需的，并且這種免疫防御的維持需要生物成本，體現(xiàn)在對(duì)黏蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育的抑制上。

研究表明，昆蟲(chóng)的免疫防御在消耗自身能量的同時(shí)往往會(huì)造成進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出生存適合度下降[36]。煙草天蛾Manduca sexta被寄生蜂寄生后或者注射滅活的細(xì)菌后血細(xì)胞的數(shù)量均會(huì)減少且取食行為受到顯著抑制[37]，東亞飛蝗 Locusta migratoria manilensis 受到侵染后，其取食量、蝻期近似消化率及食物轉(zhuǎn)化率也都出現(xiàn)顯著變化[38]，熊蜂Bombus terrestris在注入脂多糖（LPS）后其整個(gè)種群的存活率下降[39]。本試驗(yàn)對(duì)黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)注射不同濃度的球孢白僵菌孢子懸浮液，來(lái)探究6齡黏蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)注射真菌的濃度響應(yīng)。結(jié)果表明，隨著免疫脅迫強(qiáng)度的增加，黏蟲(chóng)的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，包括死亡率的升高、羽化率的降低、蛹重的降低、發(fā)育歷期的延長(zhǎng)，成蟲(chóng)壽命的縮短。首先黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率隨注射孢子的濃度升高而增加，但在105個(gè)/mL后才顯著增加，而各個(gè)濃度處理下黏蟲(chóng)體內(nèi)都發(fā)生成瘤反應(yīng)，這是由于黏蟲(chóng)在受到外界病原物入侵時(shí)其免疫防御系統(tǒng)有一定的抵抗力，大多數(shù)幼蟲(chóng)可以從相對(duì)較弱的感染（104、5×104個(gè)/mL）中恢復(fù)，表現(xiàn)為死亡率較低、蛹重、發(fā)育歷期、羽化均不受影響。蛹期是昆蟲(chóng)變態(tài)的重要時(shí)期，免疫反應(yīng)的過(guò)度消耗可能使其無(wú)法正常完成這一轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)在蛹重、羽化率及發(fā)育速度受到影響。注射白僵菌對(duì)黏蟲(chóng)蛹重及發(fā)育歷期的抑制效應(yīng)與草地貪夜蛾注射細(xì)菌后蛹重減少及發(fā)育速度降低的結(jié)果相一致[29]，但這種現(xiàn)象也僅在相對(duì)高濃度處理下出現(xiàn)。強(qiáng)的感染（106個(gè)/mL以及5×106個(gè)/mL）會(huì)導(dǎo)致各項(xiàng)生存指標(biāo)受到抑制，107個(gè)/mL濃度處理后黏蟲(chóng)死亡率達(dá)50%以上，108個(gè)/mL處理后全部死亡，由此推斷，雖然強(qiáng)烈的感染刺激下能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)瘤并激活其他免疫功能，但這些功能不足以克服和恢復(fù)昆蟲(chóng)機(jī)體所受的損傷與能源消耗，這與野外受感染昆蟲(chóng)免疫研究的結(jié)果一致[40]。

以結(jié)瘤反應(yīng)為代表的細(xì)胞免疫證實(shí)了黏蟲(chóng)對(duì)白僵菌侵染具有一定的免疫防御能力，但昆蟲(chóng)的免疫防御機(jī)制十分復(fù)雜，僅以結(jié)瘤反應(yīng)作為衡量標(biāo)準(zhǔn)可能不足以完全解釋昆蟲(chóng)體內(nèi)復(fù)雜的免疫活動(dòng)，不少研究會(huì)配合體外暴露接種的方式來(lái)共同評(píng)估昆蟲(chóng)的免疫能力[41-42]?？紤]到田間實(shí)際應(yīng)用中多在低齡幼蟲(chóng)期通過(guò)噴施菌液來(lái)進(jìn)行防治，本試驗(yàn)采用注射方法避開(kāi)了昆蟲(chóng)的體壁防御，需進(jìn)一步完善使其對(duì)田間的防治起到直接的指導(dǎo)作用。

綜上所述，球孢白僵菌可以有效誘導(dǎo)黏蟲(chóng)體內(nèi)免疫反應(yīng)且病原物的侵染對(duì)于黏蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育造成了一定的影響，但由于昆蟲(chóng)免疫防御系統(tǒng)的運(yùn)作與物質(zhì)能源的分配，誘發(fā)這種生存水平上的抑制效應(yīng)需要有足夠量的病原物的刺激。本文為研究黏蟲(chóng)對(duì)真菌感染的免疫防御和免疫代價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）