高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定涼拌菜中4種植物毒素

(石家莊市疾病預(yù)防控制中心,河北石家莊 050011)

植物毒素是指某些植物中含有的非營(yíng)養(yǎng)性天然物質(zhì)成分,或者是在儲(chǔ)存不合理的條件下產(chǎn)生的對(duì)人體健康有害的有毒成分,體內(nèi)超過(guò)一定量,則可導(dǎo)致中毒。茄堿常見于土豆中,蓖麻堿常存在于蓖麻油中,秋水仙堿常見于黃花菜中,魚藤酮存在于豆科魚藤屬植物根中。此外,魚藤酮作為一種低毒且高效的殺蟲劑,常被應(yīng)用于農(nóng)作物蟲害防治。對(duì)于人們經(jīng)常食用的涼拌菜來(lái)說(shuō),多由黃花菜、土豆絲和綠色蔬菜等拌制而成,若使用發(fā)芽的土豆則會(huì)引起茄堿中毒,食用未經(jīng)處理的鮮黃花菜會(huì)因攝入秋水仙堿含量過(guò)高而導(dǎo)致中毒,拌制涼菜使用的油若含有蓖麻油可能會(huì)引起蓖麻堿中毒,以及綠色蔬菜中若含有作為殺蟲劑的魚藤酮,也可引起中毒。已有研究表明,茄堿的毒性較低,但人只要誤食0.2～0.4 g就會(huì)出現(xiàn)惡心嘔吐、頭昏、瞳孔散大和顏面青紫等中毒癥狀,情況嚴(yán)重時(shí)因呼吸衰竭而死亡[1-2];蓖麻堿屬于劇毒生物堿,中毒表現(xiàn)為惡心嘔吐、血壓降低和呼吸困難等[3],攝入0.16 g則可使成人致死;秋水仙堿中毒類似于急性腸胃炎,其中毒癥狀與砷中毒類似,主要包括喉嚨灼熱、惡心嘔吐、腹瀉以及腎衰竭[4],劑量超過(guò)0.8 mg/kg就會(huì)導(dǎo)致心源性休克[5];魚藤酮也對(duì)人體健康具有一定的危害,主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞的ATP代謝受阻,延腦中樞先興奮后抑制,直至呼吸和血管運(yùn)動(dòng)中樞出現(xiàn)麻痹。歐盟食品安全局(EFSA)規(guī)定甘藍(lán)和黃瓜中魚藤酮的最大殘留限量(MRL)值均為0.01 mg/kg,中國(guó)臺(tái)灣省規(guī)定蔬菜中魚藤酮的MRL值為0.2 mg/kg[6],我國(guó)0.5 mg/kg[7],但國(guó)內(nèi)外對(duì)其他3種植物毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)未作出明確規(guī)定。

目前,植物毒素的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-13]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14-17]等,其他方法如紫外分光光度法[18]、薄層色譜法[19]和化學(xué)發(fā)光法[20]因靈敏度較低、針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的樣品無(wú)法準(zhǔn)確定性等不足而較少使用。有關(guān)茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮的檢測(cè)對(duì)象主要涉及生物檢材(血漿、尿液、組織液)、水與食品[3-4,14,21-22],其中食品主要為馬鈴薯、黃花菜、植物飲料和食用油,且只是對(duì)某一種基質(zhì)單一組分的測(cè)定,而關(guān)于涼拌菜中多種植物毒素的檢測(cè)未見報(bào)道?；诖?本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)建立了同時(shí)快速檢測(cè)涼拌菜樣品中茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮4種植物毒素的分析方法,為食品中植物毒素的精準(zhǔn)定性定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

涼拌菜(含有黃花菜、土豆絲等蔬菜) 購(gòu)自石家莊當(dāng)?shù)爻泻娃r(nóng)貿(mào)市場(chǎng);蓖麻堿(Ricinine)、魚藤酮(Rotenone) 純度>95%,Sigma-Aldrich公司;秋水仙堿(Colchicine)、茄堿(Solanine) 純度>95%,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈 色譜純，美國(guó)Fisher公司;甲酸 色譜純，美國(guó)Dikma公司;其他試劑 均為分析純。

1200-6410B高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源(ESI)) 美國(guó)Agilent公司;AE240電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;T-460/H超聲清洗器 德國(guó)Elma公司;C3I臺(tái)式離心機(jī) 法國(guó)Jouan公司;EVAP-12氮吹儀 美國(guó)Organomation公司;MS3渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.01 g)涼拌菜樣品于50 mL離心管中,加入10 mL正己烷∶二氯甲烷(1∶1,v/v)提取劑,渦旋30 s,振蕩提取5 min,以4000 r/min離心5 min,重復(fù)上述操作三次,合并提取液,取3 mL提取液在35 ℃下氮吹至近干,用甲醇溶解殘?jiān)⒍ㄈ莸? mL,過(guò)0.2 μm濾膜后供HPLC-MS/MS分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取適量4種植物毒素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。取適量茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇定容,得到1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用提取的基質(zhì)空白溶液逐級(jí)稀釋配成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 植物毒素的測(cè)定

1.2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL。流動(dòng)相:0. 1%甲酸水-甲醇(10︰90,v/v);等度洗脫。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);霧化氣壓力:172.4 kPa;干燥氣:N2;干燥氣流速:10 L/min;干燥氣溫度:350 ℃;毛細(xì)管電壓:4000 V;4種植物毒素的母離子、子離子、碎裂電壓(Fragmentor)和碰撞能(CE)見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)采集數(shù)據(jù)、命名及積分,Microsoft Excel 2010(美國(guó)微軟公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮的結(jié)構(gòu)中含有N、O等雜原子,易結(jié)合H+,所以采用ESI正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。首先,進(jìn)行全掃描模式(Scan)篩選母離子;其次,通過(guò)選擇性離子掃描模式(SIM)確定最優(yōu)碎裂電壓;最后,用子離子掃描模式(Product Ion)獲得定量、定性離子對(duì),同時(shí)優(yōu)化碰撞能。4種植物毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種植物毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 4 plant toxins

注:*為定量離子。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為了提高茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮的質(zhì)子化效率,在水相中加入0.1%甲酸。實(shí)驗(yàn)比較了有機(jī)相為乙腈和甲醇的分離效果、峰形及響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果顯示,當(dāng)有機(jī)相為乙腈時(shí),蓖麻堿與秋水仙堿的峰形較寬。當(dāng)選擇甲醇為有機(jī)相時(shí),四種物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)較高、峰形和分離效果較好。進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相比例,最終選擇以0.1%甲酸水-甲醇(10∶90,v/v)為流動(dòng)相,等度洗脫對(duì)四種物質(zhì)進(jìn)行分析(圖1)。

圖1 4種植物毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 4 plant toxins mixed standard solution(50 μg/L)注:1:茄堿;2:蓖麻堿;3:秋水仙堿;4:魚藤酮。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

對(duì)涼拌菜樣品進(jìn)行加標(biāo)(10 μg/kg),參照實(shí)驗(yàn)方法1.2.1進(jìn)行樣品前處理,本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿作為提取劑對(duì)4種植物毒素的提取效率。結(jié)果表明,乙腈、甲醇、乙酸乙酯和氯仿作為提取劑時(shí),4種物質(zhì)不能同時(shí)被提取,且回收率均在35%以下;只有二氯甲烷能夠?qū)⑺姆N物質(zhì)同時(shí)提取,但是回收率較低,為37.2%～46.8%。另外,二氯甲烷的密度較高,提取劑在下層,菜泥漂浮在上面,植物毒素不利于被提取,所以又在其中加入一定量的正己烷以減小溶劑密度,使提取劑在上層便于提取,并比較了不同體積比的正己烷︰二氯甲烷對(duì)4種植物毒素的回收率的影響,如表2所示。當(dāng)正己烷∶二氯甲烷體積比為1∶1時(shí),茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮的回收率均可達(dá)到70%以上。此外,還比較了萃取次數(shù)對(duì)4種植物毒素提取效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著萃取次數(shù)的增加,提取效率提高。當(dāng)萃取次數(shù)為3次時(shí),茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮的回收率最好,分別比萃取一次時(shí)提高15.5%、17.3%、17.6%和11.7%。

表3 4種植物毒素的線性范圍、檢出限與定量下限Table 3 Linear relationships,LODs and LOQs of 4 plant toxins

表2 不同體積比的正己烷∶二氯甲烷 對(duì)4種植物毒素的回收率的影響Table 2 Effect of different volume ratios of n-hexane and dichloromethane on 4 plant toxins recoveries

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect,ME)是指基質(zhì)中的共提取干擾物質(zhì)影響目標(biāo)化合物的離子化,對(duì)響應(yīng)信號(hào)產(chǎn)生影響?；|(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重影響HPLC-MS/MS分析的準(zhǔn)確性[23]。其計(jì)算公式ME(%)=A/B×100[24-25],其中:A為空白樣品基質(zhì)中添加某一濃度待測(cè)物響應(yīng)值,B為在純?nèi)軇┲刑砑油粷舛却郎y(cè)物的響應(yīng)值。ME小于100%,為基質(zhì)抑制效應(yīng);ME大于100%,為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)考察了質(zhì)量濃度為10、20、50、100 μg/L時(shí)4種植物毒素在涼拌菜中的基質(zhì)效應(yīng),得到ME為20.7%～68.6%,表明茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮這四種物質(zhì)都存在較大程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)空白溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外標(biāo)法校正,以減小基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

將1.0 mg/L的茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取的基質(zhì)空白溶液逐級(jí)稀釋,配制成0.5～200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以各化合物的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo),相應(yīng)定量離子對(duì)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮的線性方程。以3倍信噪比和10倍信噪比分別計(jì)算4種植物毒素在涼拌菜基質(zhì)中的檢出限(LOD,S/N=3)和定量下限(LOQ,S/N=10)。如表3所示,4種植物毒素在0.5～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999;方法的LOD為0.10～0.82 μg/kg,LOQ為0.32～2.72 μg/kg。

2.6 方法回收率與精密度

取涼拌菜樣品,分別進(jìn)行5、25、100 μg/kg 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定7次。由表4可見,4種植物毒素的平均回收率為72.1%～99.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.3%～8.2%。說(shuō)明本方法的準(zhǔn)確度和精密度可滿足涼拌菜中4種植物毒素的分析要求。

表4 4種植物毒素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 4 plant toxins(n=7)

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買含有黃花菜、土豆絲等蔬菜的10份涼拌菜,采用本方法對(duì)茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮進(jìn)行檢測(cè),4種植物毒素均未檢出。檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明本次從超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的10份涼拌菜加工得當(dāng),未檢出目標(biāo)毒素。盡管如此,仍需全面開展市售涼拌菜中4種植物毒素的監(jiān)測(cè),并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果,對(duì)食材的加工處理過(guò)程加強(qiáng)監(jiān)管,控制植物毒素殘留,以保證食品安全。

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)前處理方法、色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化,建立了HPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)涼拌菜中茄堿、蓖麻堿、秋水仙堿和魚藤酮4種植物毒素的分析方法。4種植物毒素在0.5～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均在0.999以上,在不同添加水平下的平均回收率為72.1%～99.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.3%～8.2%,方法檢出限為0.10～0.82 μg/kg,定量限為0.32～2.72 μg/kg。該方法操作步驟簡(jiǎn)單、定性定量準(zhǔn)確、回收率及精密度好,能夠滿足同步快速分析涼拌菜中4種植物毒素的檢測(cè)要求。