手足口病不同核酸檢測方法敏感性比較

呂厚明 房本蘭 姜亞楠

【摘 要】 手足口?。℉FMD）是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國法定報告管理的丙類傳染病。以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹和皰疹為主要癥狀。少數(shù)患者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等，個別重癥患兒病情進展快，可導致死亡。引起手足口病的腸道病毒有二十幾種，其中能夠引起比較嚴重后果的主要有兩種，分別是EV71型和CA16型。2008年手足口病在全國爆發(fā)性流行，導致眾多的重癥患兒病情嚴重，甚至發(fā)生了死亡病例，經(jīng)過實驗室檢測發(fā)現(xiàn)，2008年的主要流行型別就是EV71型，該型別也是腸道病毒中能夠?qū)е轮匕Y患兒的頭號病毒。從2008年以來，國家對手足口病越加重視，堅持不懈開展監(jiān)測工作。經(jīng)過這幾年的連續(xù)監(jiān)測，我中心對本溪市手足口病的流行情況有了大概的了解，為醫(yī)院的治療工作提供了可靠的理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 手足口病；腸道病毒；重癥患兒；EV71；CA16

【中圖分類號】 R446 【文獻標識碼】 B

手足口病的核酸檢測目前常有的方法有兩種：一是普通RT-PCR法，二是熒光定量PCR法，這兩種方法均各有利弊，現(xiàn)將這兩種檢測方法的不同特點進行對比。

1 儀器設(shè)備和試劑耗材

1.1 儀器設(shè)備 熒光定量PCR儀：IQ5型，普通PCR儀基因擴增儀：東勝創(chuàng)新EDC-810，電泳儀：瑞典EPS-601，電泳槽：上海Tanon天能HE120，紫外凝膠成像儀：日本KODAK柯達GEL LOGIC 200。

1.2 主要試劑耗材 核酸提取—QIAGEN RNA核酸提取試劑盒（No.74104），對比試劑—QIAGEN熒光定量核酸檢測試劑盒，QIAGEN一步法RT-PCR核酸檢測試劑盒，凝膠電泳—GENE TECH瓊脂糖（REGULAR），上海生工生物—5xTBE緩沖液。

1.3 檢測方法 《手足口病預防控制指南》（2009年版）。

2 檢測程序

2.1 核酸檢測

2.1.1 核酸提取 用QIAGEN RNA核酸提取試劑盒（No.74104）對樣品進行核酸提取，樣品為患兒糞便樣品，提取方式為濾柱式，將提取到的RNA核酸放置于4℃以下待用。

2.1.2 核酸擴增

A RT-PCR一步法

①核酸擴增 反應體系、反應條件和時間（EV71型）詳見表1。

②瓊脂糖凝膠電泳 配置1.5%瓊脂糖凝膠：將5x TBE緩沖液稀釋為1x——100ml緩沖液加入1.5g瓊脂糖粉充分混勻——放入微波爐內(nèi)中火加熱至沸騰，拿出搖勻，再加熱沸騰直到瓊脂糖完全溶解均勻——冷卻至45℃-50℃加入熒光染料EB替代物，100ml加1μl充分混勻——倒入擺放好的模具中至完全冷卻凝固——將凝膠放入裝滿1x TBE緩沖液的電泳槽中，淹沒膠面——將核酸產(chǎn)物混合Loading Buffer加入凝膠孔中——打開電泳儀電源，設(shè)置電壓80V-100V，至樣品跑至膠面2/3處為止——放入紫外凝膠電泳儀查看結(jié)果。詳見圖1。

共計樣品16份，加上陰陽性對照和2孔Mark DL2000，共計20孔，EV71亞型目標條帶為226bp，共得出強陽性結(jié)果8份、弱陽性結(jié)果5份、陰性3份。

B 熒光定量PCR法反應體系、反應條件和時間（EV71型）詳見表2。

結(jié)果詳見圖2、表3。

共計樣品16份，共得出強陽性結(jié)果13份、弱陽性結(jié)果1份、陰性2份。

3 結(jié)果分析

可以看出熒光定量PCR法在敏感性和檢出率方面要好于普通PCR法，而且操作步驟簡單，重復性和直觀性好，建議在檢測手足口病方面使用改方法。

4 總結(jié)

我國手足口病疫情一直比較嚴重，選擇簡單、敏感、時間短的檢測方法對疫情的防控患兒的救治有很大的幫助作用。RNA細菌是導致幼兒或其他年齡段病人感染手足口病的根本原因。在臨床診斷中，醫(yī)生通常需要運用核酸檢驗方式為病人診斷病情。核酸檢驗首先要對標本采取逆轉(zhuǎn)錄處理，使RNA以DNA的形式顯現(xiàn)，接著再分析特殊DNA的排列方式，并對DNA進行檢驗。當前基層醫(yī)院主要運用常規(guī)RT-PCR技術(shù)為病人進行檢驗，從實際檢測情況來看，受到條件局限RT-PCR技術(shù)的檢驗準確率無法達到理想效果，因此筆者在上文中，通過對比實驗分析了熒光定量PCR法和常規(guī)RT-PCR法兩種方式在臨床中檢驗小兒手足口病的效果。在常規(guī)RT-PCR檢測下，有13份標本呈現(xiàn)陽性，3份量標本呈現(xiàn)陰性。在13份呈現(xiàn)陽性的標本中，有5份顯現(xiàn)弱陽性，8份顯現(xiàn)為強陽性，檢驗準確率為50%。在熒光定量PCR檢測下，有14份標本呈現(xiàn)陽性，2份量標本呈現(xiàn)陰性。在14份呈現(xiàn)陽性的標本中，有1份份量標本呈現(xiàn)弱陽性，13份呈現(xiàn)強陽性，陽性檢驗準確率為81.25%。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可知，相比常規(guī)RT-PCR檢測模式而言，運用熒光定量法對手足口疾病標本進行檢測的陽性準確率更高。同時，熒光檢驗法使用儀器較少，并且檢驗操作簡易，即使是基層的中小型醫(yī)院也可以運用這種方式為幼兒進行手足口疾病檢驗，提高臨床診斷的準確率，使幼兒能夠及時獲得治療。因此，基層醫(yī)療單位應普及熒光定量PCR檢測法。

參考文獻

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