劉純成 劉林飛 李桂珍 張遠濤 時玉軍 楊鵬飛 劉靚
[摘要] 目的 評價結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)對潛伏性結核診斷及結核患者治療效果評價的應用價值。方法 選擇2012年12月~2014年8月44例治療后肺結核患者、50例治療后的肺外結核患者、45例潛伏結核患者(3個月服藥后)、92例肺結核病家庭密切接觸者、肺外結核患者家庭密切接觸者45例、結核病防治工作者31例、88例非結核患者家庭密切接觸者,進行外周血T-SPOT.TB檢測。 結果 治療后肺結核患者、治療后肺外結核患者和潛伏結核患者(3個月服藥后)陽性率分別為52.27%、52.00%和55.56%,正常人群陽性率為6.82%,三種類型患者陽性率與正常人群陽性率相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);肺結核患者家庭密切接觸者、肺外結核患者家庭密切接觸者和結核病防治醫(yī)務工作者的陽性率分別為30.43%、11.11%和19.35%,肺結核患者家庭密切接觸者陽性率與正常人群陽性率相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而肺外結核患者家庭密切接觸者和結核病防治醫(yī)務工作者與正常人群相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論 酶聯(lián)免疫斑點 T-SPOT.TB 實驗檢測結核敏感性強、特異性高,是快速診斷潛伏性結核感染的有效方法,是對結核患者的治療效果作出評價的有效手段,為結核病的防控提供了一個非常好的監(jiān)測手段。
[關鍵詞] 結核病;潛伏性結核;結核感染T細胞斑點試驗;陽性率
[中圖分類號] R521 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701(2015)28-0122-04
Tracking treatment of tuberculosis patients and investigation of latent tuberculosis
LIU Chuncheng1 LIU Linfei1 LI Guizhen2 ZHANG Yuantao1 SHI Yujun1 YANG Pengfei1 LIU Liang1
1.Department of Laboratory, Huai'an City Center for Disease Control and Prevention in Jiangsu Province, Huai'an 223001, China; 2.Laboratory of Molecular Biology, the Fourth People's Hospital in Huai'an City in Jiangsu Province, Huai'an 223001, China
[Abstract] Objective To investigate the value of T cells spot test (T-SPOT.TB) in tracking treatment of tuberculosis patients and investigation of latent tuberculosis. Methods From December 2012 to August 2014, peripheral blood T-SPOT.TB were measured in the 44 patients with active tuberculosis, 50 patients with extra-pulmonary tuberculosis, 45 patients with latent tuberculosis, 92 patients with close contactors of active tuberculosis, 45 patients with close contactors of extra-pulmonary tuberculosis, 31 medical workers of tuberculosis control and 88 healthy individuals. Results The positive rate of T-SPOT.TB for the diagnosis of active tuberculosis, extra-pulmonary tuberculosis, latent tuberculosis were 52.27%, 52.00%, 55.56%, and healthy individuals was 6.82%, The positive rate of those three kinds of patients was statistically significant with the positive rate of healthy individuals (P<0.01). The positive rate of close contactors of active tuberculosis, close contactors of extra-pulmonary tuberculosis, medical workers of tuberculosis control were 30.43%, 11.11% and 19.35%. The positive rate of close contactors of active tuberculosis was statistically significant with the positive rate of healthy individuals (P<0.01), while the positive rate of close contactors of extra-pulmonary tuberculosis and medical workers of tuberculosis control was no statistically significant with the positive rate of healthy individuals(P>0.05). Conclusion T-SPOT.TB assay can be an effective method for repaid diagnosis of latent tuberculosis infection and the treatment of tuberculosis patients with high specificity and sensitivity, and also is a very useful method for the prevention and control of tuberculosis.
[Key words] Tuberculosis; Latent tuberculosis; T cell spot test; Positive rate
結核病是全球嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。據世界衛(wèi)生組織(WHO)估計,全球約有1/3人口受到結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染。2010年,全球約有880萬新發(fā)結核病例,145萬人死于結核病[1]。2013年全球有900萬人罹患結核病,其中近50萬人感染的是很難治療的耐多藥結核??;2012~2013年淮安市共發(fā)現(xiàn)活動性肺結核患者4907例,新發(fā)涂陽1319例,隨著耐多藥結核病數量的不斷上升及人類免疫缺陷病毒并發(fā)感染,結核病的防治工作變得更為嚴峻[2]。當前結核的診斷存在耗時長、靈敏度低等問題,探索快速、簡便的診斷方法一直是國內外學者們研究的焦點。
根據結核感染的狀態(tài),人群可以分為無結核感染、活動性結核、潛伏性結核和治愈。潛伏性結核(latent tuberculosis infection,LTBI)是宿主感染結核分枝桿菌后尚未發(fā)病的一種特殊狀態(tài),潛伏性結核不僅威脅個人健康,亦有可能成為潛在的傳染源,對家庭和社會造成危害。結核病患者經過治療后往往缺乏有效的愈后監(jiān)測,給結核病的防控增加了許多困難。T-SPOT.TB的原理是利用結核特異抗原(ESAT.6.CFP-10),通過酶聯(lián)免疫斑點技術(ELISPOT)檢測受試者體內是否存在結核效應T淋巴細胞,從而判斷受試者是否感染結核桿菌(現(xiàn)癥感染) 的新方法。該試驗僅需24 h即可得到檢測結果,具有操作簡單、周期短、靈敏度和特異性高等優(yōu)點[3-6]。結核感染T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT.TB,Oxford Immunotec)作為結核潛伏感染的診斷手段已經在多項研究中證實具有很高的靈敏度和特異性[7-10]。為了解淮安市登記在冊的經治療的肺外結核及確診并經治療的肺結核患者以及結核患者家庭密切接觸人群和結核病防治工作者結核病潛在感染情況,本研究對上述人群進行抽樣采集血液進行T-SPOT.TB,以了解該群體的結核感染狀態(tài),利于結核病控制,現(xiàn)報道如下。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇2012年12月~2014年8月淮安市洪澤縣黃集鎮(zhèn)、朱壩鎮(zhèn)登記在冊的肺結核病患者及其密切接觸的家庭成員,其中治療后肺結核患者44例,肺外結核患者50例,年齡30~79歲,男45例,女49例;潛伏結核患者(服藥3個月后)45例、肺結核患者家庭密切接觸者92例、肺外結核患者家庭密切接觸者45例,其中男87例,女95例,3~15歲8例,16~30歲13例,30歲以上161例,年齡最小3歲,年齡最大77歲;31例結核病防治工作者,另選擇非結核患者家庭密切接觸者(正常人群)88例為對照,分別采集靜脈血5 mL,進行T-SPOT.TB檢測。
1.2 材料
RPMI 1640細胞培養(yǎng)液,細胞培養(yǎng)液AIM-V培養(yǎng)基,F(xiàn)icoll-Hyperque淋巴細胞分離液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),T-SPOT.TB試劑盒。
1.3 T-SPOT.TB試驗方法
采集肝素抗凝血5 mL,分離PBMC進行計數,保證加入反應孔中的細胞數達到2.5×105個/100 μL;每個檢測需4個反應孔,分別為陰性、ESAT-6、CFP-10、陽性孔;加好細胞和刺激源后放入5%CO2,37℃培養(yǎng)18~24 h;洗滌后加入生物素標記的二抗,反應1 h;洗滌后加入顯色劑,避光顯色7 min后,在細胞因子分泌的地方形成斑點,通過計數斑點檢測受結核特異性抗原刺激后釋放γ干擾素的效應T淋巴細胞數量。陰性孔內斑點數<6時,ESAT-6或CFP-10孔中斑點數-陰性孔≥6結果為陽性;若陰性孔內斑點數≥6時,ESAT-6或CFP-10孔中斑點數>陰性孔的2倍結果亦為陽性。
1.4 再次T-SPOT.TB檢測
對T-SPOT.TB檢測結果陽性的密切接觸者(潛伏性結核)進行預防性服藥治療,治療后再次進行T-SPOT.TB檢測。
1.5 觀察指標
觀察結核患者治療前后T-SPOT.TB檢測陽性率和陰性率。
1.6 統(tǒng)計學方法
采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件分析數據,率(%)的比較均采用χ2檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 結核患者治療后 T-SPOT.TB檢測結果比較
根據T-SPOT.TB試劑盒說明書,檢測結果見圖1。經檢測發(fā)現(xiàn),治療后肺結核患者、治療后肺外結核患者和潛伏結核患者(3個月服藥后)陽性率分別為52.27%、52.00%和55.56%,而正常人群陽性率為6.82%,χ2檢驗表明,治療后肺結核患者、治療后肺外結核患者和潛伏結核患者陽性率與對照者比較差異均具有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1、圖1。
表1 結核患者經治療后T-SPOT.TB檢測結果比較
2.2 結核患者密切接觸者T-SPOT.TB檢測結果比較
T-SPOT.TB檢測結果表明,肺結核患者家庭密切接觸者、肺外結核患者家庭密切接觸者和結核病防治醫(yī)務工作者的陽性率分別為30.43%、11.11%和19.35%,χ2檢驗表明,肺結核患者家庭密切接觸者陽性率與正常人群陽性率(6.82%)相比差異具有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01),而肺外結核患者家庭密切接觸者和結核病防治醫(yī)務工作者與正常人群比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。
表2 結核密切接觸者的T-SPOT.TB檢測結果比較
3討論
肺結核患者經治療后常采用查痰及影像學判斷患者是否有治療效果,肺外結核患者經治療后一般通過影像學和病理學檢查判斷患者是否有治療效果,而沒有檢查患者體內是否還有結核菌在繼續(xù)感染增殖。肺外結核病變部位不一致,典型的臨床癥狀不明顯,容易被忽視,以致臨床上常被誤診或漏診,需要通過臨床癥狀和輔助檢查,特別是病理檢查綜合分析診斷結核感染。Kim等[11]報道,在肺外結核患者中,T-SPOT.TB的陽性率為94%。還有試驗表明,IGRA準確性對于活動性肺內、肺外結核的診斷沒有明顯差異[12]。T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)作為結核潛伏感染的診斷手段已經在多項研究中證實具有很高的靈敏度和特異性。在結核桿菌特異性抗原刺激下,測定外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中能夠釋放IFN2γ的T細胞數量,從而判斷出體內是否還有結核菌感染。本次實驗我們采用T-SPOT.TB技術檢測經治療的肺內、肺外結核患者的血液判斷患者經藥物治療的效果,經檢測44例肺結核患者,T-SPOT.TB陽性23例,陰性21例,陽性率為52.27%;50例肺外結核患者,26例陽性,24例陰性,陽性率為52.00%,與正常人群比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=35.35、36.54,P<0.01),表明T-SPOT.TB檢測陽性者還需進一步服藥治療。
結核患者的家庭成員及結核病防治工作人員屬于密切接觸人群,為高風險人群。92例肺結核患者家庭密切接觸者陽性28例,陽性率為30.43%,肺外結核患者家庭密切接觸者45例,陽性率為11.11%,結核病防治工作者31例,陽性率為19.35%,正常人群陽性率為6.82%,肺結核患者家庭密切接觸者陽性率與正常人群陽性率相比差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=16.37,P<0.01),而肺外結核患者家庭密切接觸者和結核病防治醫(yī)務工作者與正常人群相比差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.72、3.54,P>0.05);主要由于肺結核的傳染以呼吸道傳播為主,傳播速度快,范圍廣,肺外結核因感染的部位不同,以排泄物的接觸傳播為主,多數的肺外結核(如淋巴結核、骨結核等)因不能將病原菌排出體外,對密切接觸者幾乎沒有傳染性。通過檢測說明結核患者的家庭中,更應注意結核病的防范,加強防御措施。對于已經感染的群體,應注意身體狀況。已有研究表明,很多因素會導致潛伏結核發(fā)展為活動結核,包括飲酒、體重過輕、抽煙等不良習慣。接觸者與患者的接觸時間增加, 結核潛隱感染的危險性增加, 可能與結核感染與接觸結核患者產生的時間累積效應有關[13]。醫(yī)務人員還需不斷加強自身的防范意識。
T-SPOT.TB檢測結果陽性的密切接觸者(潛伏性結核)45例,空腹采血做轉氨酶及X光檢測,X光檢測結果有1例已有輕度結核性胸膜炎表現(xiàn),轉氨酶檢測皆正常,對T-SPOT.TB檢測結果陽性的密切接觸者(潛伏性結核)進行預防性服藥治療,采取知情自愿的原則,預防性服藥方案:體重≥50 kg,異福片(內含 0.15 g異煙肼 和0.3 g利福平),1次/1 d,1次2片,服藥3個月。體重<50 kg者,異煙肼0.3 g,1次/d,利福平0.3 g,1次/d。預防性服藥90 d,并進行跟蹤觀察。90 d后,采靜脈血T-SPOT.TB檢測,檢測結果見表1。其中25例T-SPOT.TB檢測結果仍為陽性,20例陰性,陽性率為55.56%,說明此類患者體內依然存在結核致敏的效應T淋巴細胞。鑒于目前大量研究表明T-SPOT.TB在結核患者中靈敏度為95%左右[14-19],而此次檢測中T-SPOT.TB結果有45%的患者為陰性,說明此類患者體內已經沒有了結核致敏的T細胞,治療效果明顯。
T-SPOT.TB檢測是利用外周血進行檢測,相比傳統(tǒng)TST等檢測手段,簡便易行,且準確度更高。檢測物不僅局限于靜脈血、支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等,也可用于對肺內及肺外結核的診斷。T-SPOT.TB在結核病的診斷中具有良好的前景和應用價值,尤其是在潛伏性結核感染及菌陰肺結核和肺外結核的診斷與鑒別診斷中。隨著方法的改進以及新抗原的應用,T-SPOT.TB很可能會成為新一代的結核病診斷方法。本文對已治療肺結核患者、已治療肺外結核患者和潛伏結核患者(已治療)采用T-SPOT.TB檢測受試者體內是否存在結核效應T淋巴細胞,從而判斷受試者是否還存在結核桿菌感染,對結核患者的治療效果作出評價,為結核病的防控提供一個非常好的監(jiān)測手段,值得在今后的工作中進一步加以推廣。
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(收稿日期:2015-07-08)