視神經(jīng)脊髓炎患者血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)及臨床意義

解麗麗 孫一鳴 張美艷 刁劍霞 王蘇平 呂洪濤

[摘要] 目的 通過(guò)檢測(cè)視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）患者與健康人的血清神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）水平，研究GFAP水平與NMO之間的關(guān)系。 方法 收集2013年6月～2015年4月的NMO患者27例和27例健康人的血清，采用酶聯(lián)免疫吸附劑法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)樣品吸光度，計(jì)算出GFAP的濃度。 結(jié)果 NMO患者組的血清GFAP濃度高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 NMO患者組的血清GFAP濃度高于對(duì)照組，血清GFAP濃度與NMO之間有關(guān)聯(lián)。

[關(guān)鍵詞] 視神經(jīng)脊髓炎；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；酶聯(lián)免疫吸附劑法；血清

[中圖分類(lèi)號(hào)] R744.52 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）30-0001-03

Expression and clinical significance of glial fibrillary acidic protein in the seruum of neuromyelitis optic patients

XIE Lili1 SUN Yiming1 ZHANG Meiyan1 DIAO Jianxia1 WANG Suping1 LV Hongtao2

1.Department of Neurology， Dalian Central Hospital， Dalian 116033， China； 2.Department of Neurosurgery， the First Hospital Affiliated to Dalian Medical University， Dalian 116011， China

[Abstract] Objective To study the relationship between GFAP level and NMO by testing GFAP level in serum of neuromyelitis optic patients and health people. Methods Collected the serum of NMO patients （n=27） and health people （n=27） from June 2013 to April 2015. Then detected the absorbance values of the samples by using ELISA experiment， computed the concentration of GFAP. Results The concentration of GFAP in the serum were significantly higher in NMO patients than that in health people， the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The concentration of GFAP in the serum are significantly higher in NMO patients than that in health people. The concentration of GFAP is in association with NMO.

[Key words] Neuromyelitis optic； Glial fibrillary acidic protein； ELISA； Serum

視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）是一種主要累及視神經(jīng)和脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的炎性脫髓鞘性疾病，亞洲是發(fā)病率最高的地方，患者以20～40歲中青年為主，女性略多于男性，臨床上主要以視神經(jīng)和脊髓同時(shí)或相繼受累為主要特征，大多表現(xiàn)為緩解和復(fù)發(fā)的病程，發(fā)病機(jī)制和病因尚未完全清楚[1]。診斷需符合2007年Wingerchuk的NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)，治療藥物多以免疫抑制劑為主[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在NMO免疫過(guò)程中具有中樞性作用，而神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是一種星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物標(biāo)志物[2，3]。國(guó)外研究顯示[3]在NMO患者的腦脊液中GFAP濃度明顯升高，本研究主要通過(guò)檢測(cè)視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）患者（2013年6月～2015年4月）與健康人的血清神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）水平，研究GFAP水平與NMO之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院神經(jīng)內(nèi)科2013年6月～2015年4月收治的NMO患者27例（男14例，女13例）并收集患者的血清，其中年齡最小25歲，最大55歲，平均年齡（37.5±4.5）歲。另選我院體檢中心的27例健康人作為對(duì)照組。其中男13例，女14例。年齡最小22歲，最大56歲，平均年齡（36.5±12.6）歲。NMO患者組與對(duì)照組患者在性別構(gòu)成比、年齡等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 NMO患者診斷標(biāo)準(zhǔn)

（1）年齡15～60歲；（2）均符合2007年Wingerchuk制定的NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)[4，5]。必要條件：視神經(jīng)炎與急性脊髓炎。支持條件：脊髓MRI表現(xiàn)異常，病灶累及超過(guò)3個(gè)椎體節(jié)段；頭顱MRI不符合多發(fā)性硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)；血清NMO-IgG陽(yáng)性。如果必要條件全部符合，再加上支持條件中的2條，即可確診為NMO。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）曾患有腦卒中；（2）曾患有腦星形細(xì)胞瘤；（3）近期感染、組織損傷；（4）其他自身免疫性疾病。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集 空腹采集肘部靜脈血5 mL，存放于EDTA促凝試管中，之后置4℃冰箱2 h，等待血液凝固上下分層后，放到高速離心機(jī)中，3000 rpm，離心5 min，吸取上層血清，使用移液器將血清移到2 mL試管中，-20℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）酶聯(lián)免疫試劑盒（CUSABIO BIOTECH公司）。常溫離心機(jī)（Eppendorf公司，美國(guó)），微量移液器（Eppendorf公司，美國(guó)），METERTECM ∑960酶標(biāo)儀（上海醫(yī)療器械七廠），BD-132冰箱（海爾公司，青島），37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（Shel Lab，美國(guó)）。

1.4.3 ELISA檢測(cè)步驟 從冰箱取出GFAP抗體ELISA試劑盒，置室溫30 min。準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品：在標(biāo)準(zhǔn)品中加入150 μL的稀釋液，調(diào)整到20 ng/L濃度，然后倍比稀釋?zhuān)謩e稀釋為5個(gè)濃度：1200 ng/L、600 ng/L、300 ng/L、150 ng/L、75 ng/L。將標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品各稀釋5倍，每孔加40 μL的稀釋液，然后加入10 μL樣品，均勻振蕩。用封板膜密封后，37℃孵育30 min。揭開(kāi)封板膜，去掉液體，甩干，每孔加入洗滌液，放置30 s后棄掉，反復(fù)洗滌5次，干燥。每孔（空白孔除外）加入酶標(biāo)試劑50 μL。再次進(jìn)行之前步驟。每孔依次加入顯色劑A、B各50 μL，搖勻后避光顯色20 min。每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)。設(shè)置空白孔為0.450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔吸光度（OD值）。

1.4.4 結(jié)果分析 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1352.3x-426.34，根據(jù)各個(gè)樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，測(cè)得各個(gè)樣品的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

NMO患者血清GFAP的水平為（655.5±85.8）ng/L，正常人血清中GFAP水平為（249.8±26.3）ng/L；NMO患者組血清GFAP濃度高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.03，P<0.05），見(jiàn)表1、圖1。

3討論

視神經(jīng)脊髓炎是主要累及視神經(jīng)和脊髓的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，且多見(jiàn)于亞洲人。在NMO患者中，炎性機(jī)制起到了更為重要的作用，以IgG為主的免疫球蛋白沉淀與堆積在血管周?chē)?，出現(xiàn)嗜酸性細(xì)胞的浸潤(rùn)與補(bǔ)體激活則充分提示為T(mén)h2應(yīng)答。NMO患者中，相對(duì)于髓鞘脫失，星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷則更加嚴(yán)重。最近的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)水通道蛋白aquaporin-4（AQP4）抗體（NMO-IgG）是NMO特異性的免疫學(xué)標(biāo)記物[6，7]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，對(duì)神經(jīng)元起到支持和營(yíng)養(yǎng)的作用，在損傷應(yīng)答、宿主防御和組織修復(fù)中發(fā)揮重要的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況可以由GFAP的表達(dá)來(lái)反映。GFAP位于細(xì)胞核周?chē)图?xì)胞質(zhì)中，其相對(duì)分子量為5萬(wàn)，僅僅在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而且表達(dá)豐富，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的重要構(gòu)成成分，可特異性的標(biāo)示星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP的表達(dá)量可以反映腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)情況。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，膠質(zhì)細(xì)胞活化增生，胞體肥大、突起增多增長(zhǎng)，GFAP快速合成且水平增加，其體液水平是評(píng)估星形膠質(zhì)細(xì)胞增多癥和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的重要手段，可以間接反映腦損傷的程度。

GFAP的相關(guān)研究表明，在NMO中，隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的破壞，GFAP被釋放入腦脊液導(dǎo)致腦脊液中GFAP水平大幅增加[2，8，9]。Akiyuki U等[10]研究表明腦脊液中的GFAP可能是NMO的診斷標(biāo)記物。以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，NMO患者的血清中GFAP濃度明顯高于對(duì)照組，但這種升高是否與視神經(jīng)病變或脊髓病變相關(guān)，仍需要深入進(jìn)一步的研究。邵林華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后血清GFAP升高，而且其升高水平與急性期腦損傷的程度可能存在相關(guān)性。Dvorak F等[12]研究發(fā)現(xiàn)，GFAP表達(dá)量的多少可以作為研究腦損傷的膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的標(biāo)記物。NMO是一種比多發(fā)性硬化更嚴(yán)重的疾病，NMO致殘與復(fù)發(fā)的頻率和早期充分的免疫抑制治療策略密切相關(guān)[13-15]。

綜上所述，NMO患者中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性增加，引起星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死，大大增加了血腦屏障的通透性，從而顯著提高了GFAP在血清中的含量。NMO患者的血清GFAP濃度高于對(duì)照組，提示GFAP血清濃度在NMO的臨床診斷上具有一定的應(yīng)用價(jià)值，GFAP能夠早期釋放且穩(wěn)定，能夠迅速定量測(cè)定而且價(jià)格便宜，有助于臨床醫(yī)生診斷和評(píng)估患者病情，為NMO的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)，可改善患者的預(yù)后。

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（收稿日期：2015-06-02）