中藥虎杖體外抗新城疫病毒活性試驗

趙增成 傅劍 李穎 林樹乾 李桂明 黃中利 馮敏燕 宋敏訓

摘 ?要：為了篩選出有效的防治新城疫的中草藥，采用雞胚接種試驗，對虎杖煎煮液的體外抗新城疫病毒活性進行了測定，結果表明：中藥虎杖在體外對新城疫病毒具有較好的抑制作用。

關鍵詞：虎杖;新城疫病毒;雞胚試驗

中圖分類號：S858.313.76 ? ? 文獻標識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2015）04-0013-04

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種禽類的高度接觸性、傳染性、致死性疾病，是嚴重影響?zhàn)B雞業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。盡管世界各國對ND都采取了嚴密的防控措施，但它依舊是危害禽類的主要傳染病[1，2]。中藥虎杖（Rhizoma Polygoni Cuspidati）為蓼科植物虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.Et Zucc）的干燥根莖和根，虎杖性微寒、味微苦，歸肝、膽、肺經，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效。現(xiàn)代研究表明，虎杖含有多種生物活性成分，具有抗菌、抗病毒等作用[3，4]。為了尋求有效的防治新城疫的藥物，我們采用雞胚接種試驗對虎杖的抗NDV效果進行了測定。結果表明，虎杖煎煮液在體外具有極好的抗NDV作用。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?虎杖 ?中藥飲片，購自濟南宏濟堂藥店，經檢驗合格。

1.1.2 ?病毒 ?NDV F48E8株，由本所禽病研究室提供。

1.1.3 ?雞胚 ?10日齡SPF雞胚，由山東昊泰實驗動物繁育有限公司提供。

1.1.4 ?1%雞紅細胞懸液 ?采取成年健康SPF公雞血液，以3.8%枸椽酸鈉溶液（1：4）抗凝，加5倍生理鹽水洗滌，2000r/min離心5min，洗滌三次，取沉淀紅細胞用生理鹽水稀釋而成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?虎杖提取液的制備 ?稱取200g生藥置三角瓶中，加水適量浸泡1h，置電爐上煮沸后煎煮30min，倒出藥液。再同法煎煮一次。合并藥液，濃縮藥液至200ml，使每毫升藥液相當于含生藥lg。高壓滅菌后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。用前取煎煮液置微量離心管中10000r/min離心8min，取上清液。用生理鹽水分別稀釋成1、0.8、0.6、0.4、0.2g/ml 5種不同的濃度。同時取虎杖原液10ml用飽和氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.0。

1.2.2 ?NDV的傳代及效價測定 ?將NDV用0.9%滅菌生理鹽水作1000倍稀釋后經尿囊腔接種10枚SPF雞胚（0.1ml/胚）。接種后的雞胚置37℃恒溫箱培養(yǎng)96h，收獲24～96h死亡胚的尿囊液，測定HA效價。選取HA效價達1：256以上者用作試驗病毒。

1.2.3 ?雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定 ?按Reed- Muench法進行[5]，試驗采用200EID50的病毒。

1.2.4 ?虎杖提取液對雞胚的安全濃度測定 ?取以上5個稀釋度的中藥液分別接種5枚10日齡SPF雞胚，0.1ml/胚，37℃繼續(xù)孵育雞胚，觀察雞胚生長發(fā)育情況。若5枚雞胚全部存活96h以上，則判定該藥物濃度對雞胚是安全的，以此確定出藥液的最大安全濃度。

1.2.5 ?雞胚接種 ?采用尿囊腔接種法[6]，按以下兩種方式進行。同時用生理鹽水替代中藥，作為病毒對照組。

方式一，先將中藥與病毒在胚外混合作用，再接種雞胚：先將NDV稀釋成200EID50的病毒液，分別取1ml病毒液與各種最大安全濃度的中藥液1ml在微量離心管中混合，室溫下作用20min，再取混合液0.2ml尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每種藥物接種15枚雞胚。

方式二，先接種中藥，再接種病毒：先將中藥液0.1ml通過尿囊腔接種雞胚，封口，37℃孵化1h后，再接種200EID50的病毒液0.1ml，每個稀釋度的中藥液分別接種15枚雞胚。

雞胚接種完后，置37℃恒溫箱孵育96h，每日照蛋，棄去24h內的死胚，24h以后死胚及96h后存活雞胚均置4℃冰箱保存，測定尿囊液血凝效價，并觀察胚體病理變化。記錄雞胚死亡時間、死亡數(shù)及尿囊液血凝滴度。

1.2.6 ?血凝試驗 ?采用微量凝集法[7]，在96孔V型凝集板上用微量移液器每孔加入50μL生理鹽水，再吸取尿囊液50μl于第1孔中，充分混合后再從第1孔吸50μl至第2孔，依次作倍比稀釋，至第10孔，最后2孔分別作抗原及紅細胞對照，再吸取1%紅細胞懸液依次加入各孔，每孔50μl，至37℃溫箱作用20min，判定血凝滴度。

1.2.7 ?判定標準 ?觀察胚胎變化，根據(jù)各組雞胚死亡數(shù)量、死亡時間、血凝效價，與對照組進行對比分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?NDV對雞胚半數(shù)感染量的測定 ?通過測定，EID50=10-8.36/0.1ml。

2.2 ?虎杖提取液安全濃度測定結果 ?在0.2g/ml、0.4g/ml、0.6g/ml、0.8g/ml、1g/ml 5種不同的濃度下，雞胚均無出現(xiàn)死亡，表明虎杖提取液對雞胚安全性較高，藥液最大安全濃度可達1.0g/ml。

2.3 ?虎杖提取液對雞胚病毒抑制試驗結果

2.3.1 ?第一種加藥方式（即先將中藥與病毒在胚外混合再接種雞胚）結果 ?病毒對照組雞胚48h全部死亡，死亡雞胚全身充血、出血，頭、腹、背和趾部更加明顯。藥液濃度在0.4～1.0g/ml時，試驗組雞胚96h后均全部存活;藥液濃度為0.2g/ml時，96h后雞胚存活率為93.3%。數(shù)理統(tǒng)計表明，雞胚存活率各用藥組與病毒對照組相比差異極顯著（P<0.01）。從HA滴度來看，各藥物試驗組HA滴度均為0，病毒對照組為9.6，差異極顯著（P<0.01）?；⒄忍崛∫簆H調節(jié)至中性后，與調節(jié)前相比，其雞胚存活率及HA滴度均無明顯差異。雞胚死亡及平均血凝滴度結果詳見表1。

2.3.2 ?第二種加藥方式（即先接種中藥，再接種病毒）結果 ?病毒對照組雞胚48h全部死亡，而各試驗組48h時雞胚存活率為40%和60%。統(tǒng)計結果表明，48h雞胚存活率各用藥組與病毒對照組相比差異顯著（P<0.05）。從HA滴度來看，各藥物組HA滴度均低于病毒對照組，差異顯著（P<0.05）。雞胚死亡及平均血凝滴度結果詳見表2。

3 ?討論

3.1 ?在兩種接種方式中，不同濃度的虎杖提取液均表現(xiàn)出了明顯的抑制NDV的效果，這表明虎杖具有較好的體外抗NDV作用，并且隨著濃度的升高其抗病毒作用進一步增強。

3.2 ?虎杖煎煮液pH為4.0左右，呈弱酸性。在體外抗病毒試驗中，各試驗組雖然表現(xiàn)出了較好的抗病毒結果，但也有可能與藥液呈酸性抑制了病毒活性有關。為此，我們將虎杖原液pH調節(jié)到了中性。調節(jié)至中性后的虎杖液仍然表現(xiàn)出了很好的抗NDV效果，與虎杖原液相比并無顯著差異。這說明虎杖提取液的抗NDV作用與pH無關，而是虎杖自身藥效的結果。

3.3 ?虎杖中主含二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類、鞣質及多糖類化學成分。二苯乙烯類主要有白藜蘆醇（resveratro1）、虎杖苷（polydatin）及其衍生物;蒽醌類成分主要有大黃素（emodin）、大黃素甲醚、蒽苷A、蒽苷B、大黃酸、大黃酚等;黃酮類成分主要有虎杖素（reynoutrin）、槲皮素（quercetin）等[8-10]?；⒄染哂写_切的抗病毒作用，但其抗病毒活性物質基礎尚不太清楚，哪些成分對NDV具有抑制作用，還需要進一步試驗研究。

參考文獻：

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