辣椒GMS育性相關(guān)miRNA的鑒定和表達分析

劉思月等

摘 要： 研究辣椒花藥中sRNA分布，篩選育性相關(guān)miRNA，通過miRNA及其靶基因的表達分析探討miRNA對雄性育性的調(diào)控。利用高通量測序技術(shù)對辣椒細胞核雄性不育兩用系處于小孢子單核靠邊期的花藥進行sRNA測序，同時分析兩材料間miRNA的表達差異。通過qRT-PCR技術(shù)驗證差異分析結(jié)果，并對miRNA及其靶基因在小孢子發(fā)育不同時期的表達模式進行分析。在構(gòu)建的不育株和可育株兩個文庫中共發(fā)掘出857個可信度高的miRNA；篩選得到42個表達差異顯著的miRNA；通過靶基因預(yù)測與注釋，預(yù)測出的差異表達miRNA的靶基因中與繁殖有關(guān)的基因有152 個，與生殖過程有關(guān)的基因有151個。通過qRT-PCR驗證了選出的9條miRNA的存在，其表達差異與測序分析結(jié)果基本一致；單核靠邊期多數(shù)miRNA負調(diào)控其靶基因，不同發(fā)育時期其調(diào)控模式會發(fā)生變化。本研究為揭示辣椒miRNA與雄性育性的關(guān)系提供了重要信息。

關(guān)鍵詞： 辣椒； 細胞核雄性不育； miRNA； 高通量測序； qRT-PCR

Identification and expression analysis of fertility-related miRNAs for the genic male sterile line in pepper （Capsicum annuum L.）

LIU Siyue， LIU Chen， GUO Jinju， DA Fengjiao， SHEN Huolin

（Beijing Key Laboratory of Growth and Developmental Regulation for Protected Vegetable Crops·College of Agriculture and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract： The objective of this study is to investigate the distribution of sRNAs from anthers of pepper，and to screen miRNAs related to genic male sterility. By expression analysis of miRNAs and their target genes，we discussed the regulation mechanisam of male sterility by miRNAs. Using high-throughput sequencing technology，sRNA populations from anthers in late-uninucleate stage for GMS line in pepper were sequenced. qRT-PCR were performed to validate the results of sRNA sequencing and to analyze the expression profile in different developmental stages of microspore. Of the millions of high-quality sRNAs from 2 libraries，857 miRNAs of high credibility were identified，42 significant differently expressed miRNAs were screened. Prediction and annotation of target genes indicated that there are 152 targets involved in reproduction and 151 involved in reproductive process. qRT-PCR results confirmed the existence of the 9 selected miRNAs，and the expression files of most of the miRNAs is consistent with sequencing results. In late-uninucleate stage，most of miRNAs negatively regulate their targets，but the regulation file differs in different development phase. This study provides important information for uncovering the relation between miRNAs and male fertility in pepper.

Key words： Pepper； Genic male sterility； miRNA； High-throughput sequencing； qRT-PCR

辣椒是世界各地普遍栽培的蔬菜和調(diào)味品。目前，人工授粉是生產(chǎn)辣椒雜交種的主要方式，但這種方式成本高并且種子純度難以保證，而利用雄性不育系則可以克服這些缺點。本研究通過初步分析細胞核雄性不育辣椒兩用系miRNA和其靶基因的表達模式，為辣椒miRNA與育性關(guān)系的研究提供參考。辣椒細胞核雄性不育類型（genetic male sterile，GMS）因敗育徹底，恢復(fù)源廣，在雜交制種過程中發(fā)揮重要作用。迄今為止，世界各國學(xué)者已發(fā)現(xiàn)的辣椒細胞核雄性不育基因近20個，其中由國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)的不育基因有2個[1]?？寺》治龅玫降挠韵嚓P(guān)基因有CaMF2、CaPME1等[2-3]。

sRNA（small RNA）是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、抵御逆境的多種小分子RNA的總稱，miRNA（microRNA）是sRNA的一種，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類長度為20～24 nt的內(nèi)源非編碼小RNA分子，它們能通過沉默靶基因或者抑制翻譯來調(diào)控基因的表達。Lee等[4]1993年在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA lin-4，它參與線蟲發(fā)育進程的調(diào)控。最早發(fā)現(xiàn)的植物miRNA是2002年由Reinhart等[5]從擬南芥（Arabidopsis thaliana）sRNA文庫中獲得。植物中許多物種都發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA，并且大多數(shù)植物miRNA在物種間是高度保守的。據(jù)估計，編碼miRNA的基因可能占基因總數(shù)的1%～5%[6]。miRNA主要通過與靶基因的特異性堿基互補配對，從而降解靶基因或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平對動植物的基因表達進行調(diào)控[7-9]。

目前有關(guān)miRNA的研究主要包括調(diào)控植物的生長發(fā)育、逆境生理以及響應(yīng)激素信號等方面[10-15]，其中對miRNA與花粉發(fā)育關(guān)系的研究主要集中在模式植物擬南芥中[16-17]，而對于miRNA與育性的關(guān)系研究目前還較少。Schwab等[18]研究發(fā)現(xiàn)，過量表達miR156會導(dǎo)致植株在短日照條件下開花延遲和育性降低，其作用機制可能是通過靶向作用于轉(zhuǎn)錄因子SPL；Mallory等[19]在含有5個沉默突變位點的ARF17 mRNA轉(zhuǎn)基因植株中觀察到，植株表現(xiàn)出多種異常表型，包括畸形葉片產(chǎn)生、開花期提前、育性降低等。這是由于miR160作用的靶標(biāo)——ARF17 mRNA含有5個沉默突變位點，導(dǎo)致miR160不能正常介導(dǎo)ARF17 mRNA的切割。雖然這些研究初步證明了miRNA與植物育性的相關(guān)性，但是要揭示具體的調(diào)控機制，目前的研究成果還相當(dāng)匱乏，辣椒中更是未見報道。

研究表明，辣椒的小孢子單核靠邊期是花粉敗育的重要時期[20-22]，并且是許多已報道育性相關(guān)基因表達差異大的時期[23-24]。因此，本試驗通過對辣椒GMS小孢子單核靠邊期建立miRNA差異表達文庫，研究其與育性的關(guān)系。通過建立辣椒小孢子單核靠邊期差異表達的miRNA文庫，篩選差異表達miRNA并預(yù)測其靶基因，利用qRT-PCR技術(shù)驗證差異分析結(jié)果并鑒定miRNA與靶基因相關(guān)關(guān)系，為辣椒miRNA育性調(diào)控功能研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用GMS兩用系辣椒材料‘629AB由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)辣椒課題組提供。2014年春在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站大棚內(nèi)種植，常規(guī)管理。在開花期，分別收集不育株和可育株的花蕾，根據(jù)小孢子發(fā)育時期與花器官形態(tài)的相關(guān)性，將收集到的花蕾分為四分體時期、單核早中期、單核靠邊期和雙核期[25]，剝?nèi)』ㄋ幉⒘⒓从靡旱鋬觯?80 ℃保存待用。

1.2 small RNA文庫的測序及生物信息學(xué)分析

1.2.1 總RNA的提取，sRNA文庫的建立并測序

Trizol（Invitrogen公司，美國）法分別提取不育株和可育株單核靠邊期花藥RNA。用NanoDrop紫外分光光度計檢測濃度和純度（RNA濃度≥500 mg·L-1，OD260/280為1.8～2.2，260 nm處有正常峰值），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性（RNA 28S/18S≥1.5）。

樣品檢測合格后，利用sRNA的3及5端特殊結(jié)構(gòu)（5端有完整的磷酸基團，3端有羥基）的特征，以總RNA為起始樣品，在sRNA的3端和5端添加接頭，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。經(jīng)過PCR擴增，PAGE凝膠電泳分離目標(biāo)DNA片段，切膠回收得到cDNA文庫。經(jīng)檢測合格后，利用HiSeqTM 2500基因分析儀測序。

1.2.2 miRNA鑒定 原始reads經(jīng)過過濾低質(zhì)量并除去無接頭后長度小于18 nt和大于30 nt的reads，最終得到clean reads。將clean reads分別與GenBank庫（http：//www.ncbi.nih.gov./genebank/）、Rfam庫（http：//rfam.sanger.ac.uk/）比對，去除其他ncRNA（非編碼RNA，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA）序列，剩下的與參考基因組比對獲得比對到基因組的序列。對于比對到參考基因組的序列，利用miRDeep2軟件進行miRNA前體預(yù)測，軟件對star序列、序列數(shù)目、MFE（最小折疊自由能））、cons.seed等分別進行打分，最終分?jǐn)?shù)大于0即為前體序列。

預(yù)測到了前體序列則可以確定前體序列中的成熟序列、環(huán)狀結(jié)構(gòu)、star序列的位置，將比對到成熟序列位置上的序列提取出來即為成熟的miRNA。

將預(yù)測到的前體序列和成熟序列與miRBase數(shù)據(jù)庫中的所有植物做比對，來定義保守miRNA和非保守miRNA。

1.2.3 microRNA差異表達分析 整合2個樣品中比對到各miRNA上的reads數(shù)，利用IDEG6，選取FDR<0.01且Fold Change>=2作為標(biāo)準(zhǔn)，進行差異表達分析。FDR（False Discovery Rate）表示錯誤發(fā)現(xiàn)率，它是通過對p-value進行校正得到的。轉(zhuǎn)錄組中的差異miRNA分析是對大量的miRNA進行獨立的統(tǒng)計假設(shè)檢驗，它會導(dǎo)致總體假陽性偏高的問題，因此在差異軟件進行差異分析過程中，采用Benjamini Hochberg校正方法[26]對原有假設(shè)檢驗得到的p-value進行校正，最終采用FDR作為差異基因篩選取得的關(guān)鍵指標(biāo)。

1.2.4 靶基因預(yù)測及注釋 利用預(yù)測的miRNA序列信息和辣椒基因組中的序列信息文件，通過TargetFinder軟件進行靶基因預(yù)測。靶基因預(yù)測的罰分系統(tǒng)如下：1）錯配、單堿基缺失和凸起分別罰1分；2）出現(xiàn)G：U配對罰0.5分；3）microRNA 5端的第2～第13位堿基出現(xiàn)G：U以外的錯配罰1分。若配對出現(xiàn)以下情況則認(rèn)定其不是該miRNA的靶基因：1）多于1個單堿基缺失或凸起；2）錯配、G：U配對、缺失或凸起的總數(shù)大于7；3）多于4個錯配數(shù)或多于4個G：U配對。最終罰分小于或等于3則預(yù)測其為該miRNA的靶基因。

使用BLAST軟件將預(yù)測得到的靶基因序列與GO數(shù)據(jù)庫[27]比對，獲得靶基因序列的注釋信息。

1.3 qRT-PCR分析

1.3.1 miRNA的qRT-PCR檢測 Trizol法分別提取小孢子四分體時期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期4個時期的總RNA。檢測濃度和完整性后，置于-80 ℃ 貯存?zhèn)溆?。利用miRNA cDNA Kit（康為世紀(jì)，中國）進行miRNA對應(yīng)的cDNA第一鏈合成：首先在miRNA3末端加多聚A尾的方法來使miRNA具有Poly（A）尾，之后再使用Oligo（dT）-Universal tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終合成miRNA對應(yīng)的第一鏈cDNA。最后用熒光定量 PCR 檢測 miRNA 的表達情況。實時熒光定量利用miRNA Real-Time PCR Assay Kit（康為世紀(jì)，中國），按照說明冰上配制下列反應(yīng)體系：2×miRNA qPCR premix（With SYBR and ROX） 10 μL，F(xiàn)orward primer（10 μmol·L-1） 0.4 μL，Reverse primer（10 μmol·L-1） 0.4 μL，miRNA第一鏈cDNA模板2.5 μL，RNase-Free Water補足20 μL反應(yīng)體系。利用ABI 7500熒光定量PCR儀執(zhí)行以下反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 1 min，45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線，記錄Ct值并計算2-ΔΔCt。Reverse primer使用試劑盒自帶引物，F(xiàn)orward primer序列列于表1。

1.3.2 靶基因qRT-PCR檢測 小孢子發(fā)育4個時期總RNA的提取方法和檢測方法同上。利用PrimeScript? II 1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara公司，日本）按照說明書進行cDNA第一鏈的合成，然后利用Promega GoTaq qPCR Master Mix（Promega公司，美國）冰上配制反應(yīng)體系：2×GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward primer（10 μmol·L-1） 0.4 μL，Reverse primer（10 μmol·L-1） 0.4 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free Water 7.2 μL共20 μL的反應(yīng)體系。利用ABI 7500熒光定量PCR儀執(zhí)行以下反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線，記錄Ct值并計算2-ΔΔCt。引物序列列于表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果統(tǒng)計

分別對小孢子發(fā)育單核靠邊期的不育株和可育株的花藥進行Illumina測序。2個材料通過測序，過濾低質(zhì)量reads、接頭及過長過短序列，最終得到clean reads分別為19 852 077、16 503 277條。通常，sRNA庫的測序結(jié)果在成分上比較復(fù)雜，除了包括大量miRNA和siRNA，還有來自其他編碼和非編碼序列的降解片段，因此將這些clean reads分別與GenBank庫、Rfam庫比對，提取注釋信息 （表3）。

不育株中匹配到參考基因組（http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp）的序列有9 489 233條，占總序列數(shù)的47.80%，可育株中可以匹配到的序列有7 464 111條，占總序列數(shù)的45.23%（表3）。

表3 clean reads分類注釋結(jié)果

2個文庫的sRNA結(jié)果顯示，不育株和可育株中的sRNA都是以24 nt最多，分別占總數(shù)的51.28%、51.63%。miRDeep2預(yù)測得到不育株和可育株的miRNA長度主要在21、22、24 nt。分析miRNA位點對堿基的偏好發(fā)現(xiàn)，miRNA成熟體序列首位堿基對堿基U具有很強的偏向性。2個庫共發(fā)掘出857個可信度高的新的miRNA，與miRBase數(shù)據(jù)庫比對后得到保守的miRNA有262個，非保守的有595個。

2.2 差異表達的miRNA

2個庫共篩選出42個差異顯著表達的miRNA，其中可育株相對于不育株表達上調(diào)的有16個，下調(diào)的有26個。上調(diào)的16個miRNA中，有3個保守的miRNA和13個非保守miRNA。下調(diào)的miRNA中，有11個保守miRNA，15個非保守miRNA。

2.3 靶基因預(yù)測及注釋

找到miRNA所調(diào)控的mRNA靶標(biāo)對理解miRNA的生物功能至關(guān)重要。在857個預(yù)測得到的miRNA中，有733個可以預(yù)測到靶基因，共預(yù)測到12 374個靶基因，其中223個保守的miRNA共預(yù)測到4 850個靶基因，510個非保守的miRNA共預(yù)測到7 524個靶基因（表4）。

對預(yù)測得到的miRNA的靶基因進行GO分類注釋，共注釋到6 879個靶基因，其中，差異表達的miRNA靶基因共注釋得到2 176個，與總的靶基因GO分類相比，差異miRNA的靶基因在細胞過程和免疫系統(tǒng)過程方面有較多富集。

所有靶基因中與繁殖有關(guān)的注釋到527個，與生殖過程有關(guān)的基因有523個。差異miRNA的靶基因在2種分類中分別為152和151個。經(jīng)過進一步的分級注釋，篩選得到6個注釋與生殖有關(guān)的靶基因（表5）。其他還包括一系列調(diào)控分生組織營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的基因。

表5 GO注釋與生殖有關(guān)的部分

2.4 qRT-PCR

為了驗證新預(yù)測的miRNA在辣椒中的真實性、在小孢子發(fā)育的不同時期表達量變化情況及其與靶基因的關(guān)系，選取9條miRNA與其相應(yīng)的9條靶基因，根據(jù)序列設(shè)計引物，用qRT-PCR對辣椒小孢子發(fā)育的4個時期的miRNA和靶基因進行檢測（表6）。為了驗證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取了Capana08g000340、Capana08g000534、Capana00g000886為測序數(shù)據(jù)顯示有顯著表達差異的miRNA對應(yīng)的靶基因。Capana04g001683、Capana06g002954、Capana12g002894為表達差異大并在GO分類中與生殖相關(guān)的基因，CaSEP1、CaPROF、CaNAC為本實驗室篩選得到的育性相關(guān)候選基因。

[注] CaSEP1、CaPROF、CaNAC在基因組中的編號分別為Capana02g003249、Capana06g001250、Capana03g003315。

熒光定量融解曲線顯示各miRNA及靶基因擴增產(chǎn)物為單峰，表明9條miRNA在辣椒中真實存在。unconservative_Chr00_6109657、conservative _Chr00_6253770、unconservative_Chr05_2660285在兩樣本中表達差異大，在單核靠邊期，3條miRNA在不育株中的表達量分別是可育株的2.74倍、3.83倍、2.74倍，與測序結(jié)果一致。

9個miRNA在辣椒小孢子發(fā)育的不同時期中均有不同程度的表達，CaSEP1、CaPROF、CaNAC這3個實驗室篩選到的基因?qū)?yīng)的miRNA呈現(xiàn)一致的表達趨勢，即前期表達量較低，單核靠邊期表達量顯著增加，達到最高，雙核期表達量又迅速下降，不育株和可育株中趨勢變化一致。GO分類中與育性相關(guān)的靶基因?qū)?yīng)的miRNA表達趨勢各不相同，但從總量來看，單核靠邊期都是這3條miRNA大量表達的時期，同時又是unconservative_Chr06_2966220、unconservative_Chr00_6146461這2條miRNA的表達量顯著差異的時期，在不育株中的表達量分別是可育株的13.21倍和2.31倍（圖1）。

分析這些miRNA在4個時期表達趨勢變化，發(fā)現(xiàn)最多的一類就是四分體時期、單核早中期表達量相對低，單核靠邊期表達量顯著增高，雙核期又明顯下降。

靶基因方面，在小孢子發(fā)育的不同時期，選取的9條靶基因呈現(xiàn)各異的表達趨勢，并且在不同階段，與其相應(yīng)的miRNA存在的相關(guān)關(guān)系各不相同。從本試驗選出做qRT-PCR的miRNA相對表達豐度最高且表達差異比較大的單核靠邊期來看，有 7個miRNA與其相應(yīng)的靶基因呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系。但這種負相關(guān)關(guān)系從各個時期來看并不嚴(yán)格，會因為時期的不同和表達量變化而呈現(xiàn)其他相關(guān)關(guān)系。例如，unconservative_Chr00_6146461與其靶基因Capana12g002894在單核靠邊期、雙核期表現(xiàn)負相關(guān)，但在四分體時期和單核早中期卻呈現(xiàn)正相關(guān)（圖1）。

3 討 論

近年來對于植物miRNA的研究越來越深入，但主要集中在擬南芥[28-29]、水稻[30]等模式植物上，對辣椒的miRNA研究少有報道，關(guān)于辣椒miRNA的測序研究主要關(guān)注miRNA在不同組織中的表達[31]。本研究第一次從細胞核雄性不育兩用系的角度利用高通量測序技術(shù)對辣椒miRNA進行了分析，通過qRT-PCR技術(shù)探討了miRNA及其靶基因在不同發(fā)育時期的表達模式以及二者的關(guān)系，為闡明miRNA對辣椒雄蕊育性的影響提供了依據(jù)。

本試驗預(yù)測得到的sRNA的長度分布以24 nt最多，這與許多已報道的物種擬南芥[32]、小麥[33]和棉花[34]中24 nt的sRNA分布最多情況一致。已報道的辣椒miRNA長度多在21 nt[35]，本研究的結(jié)果表明，miRNA的序列長度主要分布在21、22、24 nt，這是對前人研究結(jié)果的驗證和補充。miRNA成熟序列首位堿基對U具有很強的偏向性，這一結(jié)果符合了前體miRNA（pre-miRNA）在Exportin-5幫助下轉(zhuǎn)運到細胞核外，由細胞質(zhì)Dicer酶對特異位點進行酶切的特性[36]。2個材料共預(yù)測出857個miRNA，其中差異表達的有42個，差異表達miRNA對應(yīng)的靶基因多富集在辣椒的新陳代謝過程中，說明在辣椒小孢子單核靠邊期，miRNA可能是通過調(diào)節(jié)新陳代謝來調(diào)控育性。

通過對挑選出的9個miRNA與其靶基因進行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)miRNA在單核靠邊期表達差異最大，并負調(diào)控其靶基因。之前的研究表明unconservative_Chr11_4964464的靶基因與雄蕊發(fā)育有關(guān)，unconservative_Chr12_5488192的靶基因與花粉的萌發(fā)和花粉管的生長有關(guān)[23]，這2個miRNA在單核靠邊期均大量表達并負調(diào)控其靶基因。這一時期多數(shù)miRNA與其靶基因的負相關(guān)關(guān)系一定程度上反映了miRNA與其靶基因的負調(diào)控模式。miRNA負調(diào)控其靶基因此前已多有研究[7-9]，其中育性調(diào)控方面也是如此。例如植物過量表達miR156后，其靶標(biāo)的一類轉(zhuǎn)錄因子基因SPL表達量減少，出現(xiàn)短日照條件下開花延遲、育性降低的現(xiàn)象[18]。miR160合成減少時，其靶標(biāo)ARF17會積累，植株出現(xiàn)育性降低的現(xiàn)象[19]。另外，本試驗的結(jié)果顯示，有少數(shù)miRNA與其靶基因并不存在嚴(yán)格的負相關(guān)關(guān)系，同一miRNA在不同時期可能呈現(xiàn)不同的相關(guān)關(guān)系，這些結(jié)果可能與之前報道的miRNA與其靶基因呈現(xiàn)“一對多”（一個miRNA對應(yīng)多個靶基因）、“多對一”（多個miRNA對應(yīng)一個靶基因）的對應(yīng)關(guān)系有關(guān)[19]。因此我們進一步推測不同時期miRNA側(cè)重調(diào)控的靶基因不同，同一時期發(fā)揮主要作用的miRNA不同。

本研究證明了前期發(fā)現(xiàn)的育性相關(guān)基因和本試驗中預(yù)測的部分育性相關(guān)基因與其對應(yīng)miRNA間的負相關(guān)關(guān)系，說明miRNA可能是通過負調(diào)控其靶基因進而影響辣椒育性。但是，由于目前辣椒育性相關(guān)基因的報道較少，育性決定基因也沒有被克隆，辣椒細胞核雄性不育的分子機理尚不明確，miRNA與育性的確切關(guān)系也還需要進一步的驗證。

4 結(jié) 論

本研究分析了辣椒細胞核雄性不育兩用系花藥中sRNA的分布情況，篩選得到了一系列在兩材料中表達差異顯著的miRNA，這些miRNA的靶基因多富集在新陳代謝過程中，并且與生殖直接相關(guān)的靶基因功能涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、多細胞生物生殖相關(guān)、生殖中涉及到的細胞過程、有性生殖等方面，這些miRNA與其靶基因為辣椒育性研究提供了重要信息。本研究初步分析了細胞核雄性不育辣椒中的miRNA和其相應(yīng)靶基因的表達模式，為辣椒育性相關(guān)miRNA的功能研究提供了參考。

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