大鼠體內川芎多成分序貫代謝研究

呂貝然等

摘要：目的 研究川芎單味藥中多成分體內動態(tài)變化過程，闡明其體內代謝輪廓。方法 采用高效液相色譜法建立川芎水提液指紋圖譜，以此同時檢測多成分變化情況。體內代謝采用封閉腸環(huán)法研究川芎口服后多成分經(jīng)胃-腸-肝代謝變化過程。結果 川芎水提液指紋圖譜中監(jiān)測到17種成分，在胃腸道穩(wěn)定性研究中均基本穩(wěn)定，其中有4種成分被腸道菌代謝，3種成分被肝代謝，2種新成分是腸代謝產(chǎn)物，1種新成分是肝代謝產(chǎn)物。結論 采用序貫代謝，運用封閉腸環(huán)法研究中藥口服后各成分代謝輪廓是可行的，為中藥的代謝研究提供了實驗依據(jù)。

關鍵詞：川芎；多成分；序貫代謝；封閉腸環(huán)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.04.022

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）04-0077-06

Study on Multicomponent Sequential Metabolism in Rats with Chuanxiong Rhizoma LV Bei-ran， YANG Wen-ning， TANG Ming-min， WEI Li， MA Xiao-yun， LUO Zhi-qiang， LIU Yang （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

Abstract：Objective To study the multicomponent in vivo dynamic process in Chuanxiong Rhizoma；To elaborate in vivo metabolic profiling. Methods HPLC was used to establish the fingerprint of aqueous extract of Chuanxiong Rhizoma， and multicomponent changes were detected at the same time. Closed-loop intestine method was used to study the multicomponent changes of oral administration of Chuanxiong Rhizoma after stomach-intestine-liver process. Results Totally 17 components were detected in the fingerprint of aqueous extract of Chuanxiong Rhizoma and they were basically stable in the digestive juice. For in vivo metabolism， 4 components were metabolized by intestinal flora；3 components were metabolized by liver；2 new components were the metabolites of intestinal flora；1 component was the metabolite of liver. Conclusion Multicomponent sequential metabolism and closed-loop intestine method were used to clarify that multicomponent metabolic profiling was feasible， and it could provide experimental basis for the metabolism of traditional Chinese medicine.

Key words：Chuanxiong Rhizoma；multicomponent；sequential metabolism；closed-loop intestine method；rats

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，具有活血行氣、祛風止痛功效，臨床上廣泛用于治療心血管疾病。目前研究川芎單體成分代謝的較多，如以藁苯內酯為主的川芎揮發(fā)油的代謝[1-3]、藥典指標成分阿魏酸的藥代和體內代謝[4-6]和以川芎嗪為代表的生物堿的代謝[7-8]。而關于川芎單味藥多成分同時代謝的研究較少[9-10]。此外有研究表明，在臨床應用中不應簡單地用純品單體

基金項目：國家自然科學基金（81274042）

通訊作者：劉洋，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn

的藥動學及代謝參數(shù)來推測服用單味中藥后其有效成分的體內過程，如藁苯內酯以單體及川芎提取物形式口服后，以川芎提取物服用的藁苯內酯的消除率明顯高于以單體形式服用[11]。另有報道，大鼠灌胃阿魏酸對照品、川芎藥材提取物、復方腦得生片后阿魏酸的Cmax值為阿魏酸對照品組>復方腦得生片>川芎藥材提取物[12]。因此，將川芎中的多成分作為一個彼此相互聯(lián)系的整體，研究其在體內代謝的相互影響是非常有必要的。本研究采用對照比較法依次進行消化液及消化酶代謝、腸道菌群代謝、腸壁代謝、肝代謝研究。因4個過程在空間和時間上保持連續(xù)性，因此將其命名為“序貫代謝”。通過指紋圖譜跟蹤記錄川芎口服后多成分序貫代謝過程動態(tài)變化，運用動物實驗研究川芎藥材多成分整體代謝，定性闡明有效成分代謝過程，為川芎的臨床用藥提供合理的實驗依據(jù)。

1 儀器、試藥與動物

Waters液相色譜系統(tǒng)（600四元泵，美國Waters公司），2487雙波長紫外檢測器，Empower 2工作站；電子分析天平（BT-25S，北京賽多利斯儀器有限公司）；pH酸度計（FE20，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；1-15PK離心機（德國Sigma公司）。

川芎飲片（北京同仁堂藥店）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學張貴君教授鑒定為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；三氟乙酸（synthesis grade）購于Scharlau Chemie S.A.公司（西班牙巴塞羅那）；1-氨基苯并三唑（北京百靈威有限公司）；娃哈哈純凈水購于娃哈哈集團公司（中國杭州）；其余試劑均為分析純。

SPF級健康雄性SD大鼠，6周齡，體質量（300±40）g，北京斯貝福實驗動物科技有限公司提供，動物合格證號SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)于符合國家標準的屏障環(huán)境中，室溫22～24 ℃，相對濕度60%。實驗前適應性喂養(yǎng)1周以上，自由飲水和進食。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 Krebs-Ringer's營養(yǎng)液配制 稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl2 0.37 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g、MgCl2 0.02 g、葡萄糖1.40 g，加蒸餾水定容至1000 mL，調節(jié)pH為7.39～7.41，放置備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取飲片100 g，精密稱定，置具有冷凝回流裝置的圓底燒瓶中，加1000 mL去離子水，浸泡1 h后回流提取1.5 h，趁熱過濾出提取液。再向燒瓶中加入1000 mL去離子水，回流提取1 h，趁熱過濾出提取液。合并提取液。濾液經(jīng)過水浴濃縮，并用K-R營養(yǎng)液定容至100 mL，制成含原藥材1 g/mL的溶液。

2.1.3 人工胃液的配制 取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL，與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋至1000 mL，即得[13]。

2.1.4 人工腸液的配制 取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.8；另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000 mL，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫30 ℃，檢測波長280、300 nm，流速1 mL/min，流動相為0.1%三氟乙酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，98%A；30 min，66%A；35 min，35%A；50 min， 0%A）。

2.3 序貫代謝

2.3.1 胃腸道穩(wěn)定性研究 消化液預溫孵5 min后，分別在50 mL胃液和50 mL腸液中加入1 mL供試品溶液，在37 ℃振搖情況下分別溫孵。人工胃液中溫孵6 h，每隔1 h取樣7 mL，立即用0.1 mol/L NaoH調pH為6～7從而終止反應，并用去離子水定容至10 mL。人工腸液溫孵8 h，每隔1 h取樣7 mL，并用去離子水定容至10 mL。溫孵液過0.45 μm濾膜，進行液相測定，對比分析溫孵后藥液的指紋圖譜。

2.3.2 腸道菌代謝研究 5只SD大鼠禁食12 h，自由飲水，分為2組，4只為供血組，1只為實驗組。

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，供血組腹主動脈取血，血液放于肝素化離心管，置于37 ℃水浴鍋中保溫。實驗組大鼠頸靜脈插管輸血，保證實驗過程的血液損失得到補充，腸系膜靜脈插管收集血液。沿腹中線打開腹腔約3～4 cm選取結腸，在腸段首末端系上絲線，用注射器將藥液注入腸腔。當藥液到達腸段末端，用絲線結扎，然后取下注射器并結扎腸段前段。通過蠕動泵從頸靜脈給實驗鼠供血。在蠕動泵另一端開始收集血液，同時結扎門靜脈，待實驗完成后，收集腸道內藥液。

無腸道菌實驗手術方法與有腸道菌實驗相同，僅在藥液注入小腸前，于小腸末端切一橫向口，用溫熱的生理鹽水洗凈腸內容物后再進行后續(xù)操作。實驗持續(xù)1.5 h，收集的血液放入肝素化離心管中，4000 r/min離心10 min，取上清液，加入3倍量甲醇，渦旋2 min， 10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜，進行液相分析。

2.3.3 腸壁酶代謝研究 采用無腸菌實驗的手術方法。在多成分藥液注入腸道循環(huán)前，將非特異性CYP450酶抑制劑氨基苯并三唑加入沖洗液和藥液中。1 h后腸系膜靜脈收集18 mL血樣，處理方法同腸道菌實驗。

2.3.4 肝代謝研究 肝代謝后多成分進入血液系統(tǒng)，采用封閉腸環(huán)法，將川芎藥液封閉在結腸，不需要供血，不結扎門靜脈，1 h后腹主動脈采血約10 mL，樣品處理同腸道菌實驗。

3 結果

3.1 胃腸道穩(wěn)定性

胃腸道的酸堿物理環(huán)境及消化酶均有可能改變化學成分的結構，因此口服藥物經(jīng)過消化道多成分的變化情況值得研究，這也是序貫代謝的第一步。前期研究已顯示川芎在消化道溶出情況良好[14]，本實驗通過川芎藥液指紋圖譜對比分析溫孵前后多成分的變化。成分變化用相對于溫孵0 h的峰面積變化率f表示。并規(guī)定f>10%則認為此成分不穩(wěn)定。圖1為川芎藥液的指紋圖譜，圖中共標出17種藥材中的成分（C1～C17），此17種成分的胃腸道穩(wěn)定性結果見表1。從數(shù)據(jù)可知，成分6在人工胃液及人工腸液中fmax>10%，成分7、12、13在人工腸液中fmax>10%，但這些均是經(jīng)人工胃液6 h及人工腸液8 h孵育后其變化率大，而一般藥物在胃滯留時間不超過2 h，腸滯留時間不超過4 h。因此認為川芎藥液中多成分在胃腸道中比較穩(wěn)定。川芎藥液在人工胃液和人工腸液中溫孵不同時間的HPLC圖譜見圖2、圖3。

3.2 腸道菌代謝

肝臟和小腸是外源性物質代謝的主要器官[15]。腸內細菌對中藥成分的生物轉化以水解為主，氧化和還原反應為輔，所涉及的代謝酶主要有水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉移酶[16]。通過比較有菌和無菌條件下血漿樣品中多成分HPLC圖譜得出腸道菌代謝情況。為了更清楚說明代謝，以成分16作為內參（此峰峰面積最大且在人工胃液和人工腸液中相對偏差為3.27%和2.89%，比較穩(wěn)定），用各種成分相對峰面積來說明各成分代謝情況。由表2和圖4中A與B比較可知，成分1在有腸菌和無腸菌的血漿中均未檢測到，說明其可能被酶代謝或者吸收較弱。成分6、7、13和15在有腸道菌的血漿樣品中均未檢測到，說明其可能被腸道菌代謝掉。成分3在腸道菌的血漿樣品中相對峰面積增加很大，說明其吸收較成分16強或者是其他成分代謝產(chǎn)物。同時有7種新成分產(chǎn)生。新成分1、2只在有菌群的血漿樣品中檢測到，表明其是腸道菌的代謝產(chǎn)物。新成分3、4、5、6、7在2種血漿樣品中均能檢測到，說明這些成分不是腸道菌代謝產(chǎn)物，可能是酶代謝產(chǎn)物。

3.3 腸壁酶代謝

腸在藥物的全身代謝中占有重要的地位，腸壁酶的首過代謝通過一些化學藥品被證實，但多成分代謝研究的文獻相對較少。其結果通過比較有無酶抑制劑情況下的多成分指紋圖譜得到。從表2和圖4中B與C比較可知，成分1仍未檢測到，說明其被代謝或者未吸收，結果仍不確定。成分4相對峰面積增加很多，說明其可能是由其他成分轉化而來，也可能是CYP450酶抑制劑的底物。在這2種血漿樣品中，成分11相對峰面積增加很大，說明可能是非CYP450酶的代謝物。

3.4 肝代謝

大多數(shù)藥物在進入全身血液前都會經(jīng)歷肝代謝，豐富的Ⅰ相反應和Ⅱ相反應酶是藥物代謝的主要原因。肝代謝結果通過比較腹主動脈血和有菌血樣中多成分的HPLC指紋圖譜得到。從表2和圖4中A與D比較可知，成分1在2種血漿樣品中未檢測到，所以仍不能確定其是否代謝或者吸收。成分6、7、13和15在有腸菌和肝代謝血中均未檢測到，說明最可能是被腸道菌代謝。成分2、3、8只在動脈血中消失，說明其被肝臟代謝。新成分8只在動脈血中檢測到，說明其是肝代謝產(chǎn)物。新成分3、4、5、6、7相對峰面積在腹主動脈血中明顯增大，說明它們是肝代謝產(chǎn)物。

3.5 各成分可能代謝位點

通過綜合分析4個連續(xù)實驗結果，將每種成分可能代謝位點一一列出，結果見表3。

4 討論

本研究結果顯示，川芎主要成分多為原型吸收進入體液循環(huán)，鎖定的17種原型成分中9種成分原型吸收入血，1種成分未吸收或被酶代謝，4種成分被腸道菌代謝，3種成分被肝代謝，2種新成分是腸代謝產(chǎn)物，1個新成分是肝代謝產(chǎn)物。定性闡述川芎多成分在大鼠體內的動態(tài)過程，初步表明序貫代謝的可行性。

某些成分在胃腸道穩(wěn)定性研究中不太穩(wěn)定，但其變化均在4、6、8 h時變化率比較大，一般藥物在胃滯留時間不超過2 h，腸滯留時間不超過4 h[17]。因此可以認為川芎藥液中多成分在胃腸道中比較穩(wěn)定。

川芎中單一成分的體內代謝研究已很清楚，其整體用藥的多成分藥代動力學研究不多，而川芎單味藥中多成分體內動態(tài)代謝情況尚未見報道。本研究采用序貫代謝，運用封閉腸環(huán)法探討了多成分體內動態(tài)代謝情況，更加形象地反映其在體內的吸收代謝輪廓，同時從中藥多成分環(huán)境角度出發(fā)更符合中藥用藥特點，為中藥代謝研究提供一種可參考的方法。為進一步闡明川芎藥效物質基礎，筆者下一步會進行液相色譜-質譜分析，對代謝和入血成分進行結構解析。

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（收稿日期：2014-12-10；編輯：陳靜）