艾納香不同部位多酚和黃酮類抗氧化活性研究

韋睿斌 ，楊 全 ，龐玉新，袁 蕾，張影波，王中洋，孫懂華

1廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 510006;2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，儋州 571737;3 海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，儋州 571737

艾納香［Blumea balsamifera (L.)DC.］為菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物或亞灌木，別名大風(fēng)艾、冰片艾等，主要藥用部位為全草或者地上部分，產(chǎn)于貴州、廣西、廣東、海南等地［1］。早在1980 年，Wat 等［2］就對(duì)菊科44 種草本植物和兩種新鮮植物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)艾納香具有光敏性和對(duì)大腸桿菌和白色念珠菌抑制作用等生物活性。近年來，在單體分離的基礎(chǔ)上，國內(nèi)外學(xué)者如許實(shí)波［3］、Saewan［4］、Haswgawa［5］等對(duì)艾納香及其提取物的生物活性和藥理活性進(jìn)行了詳盡的研究，結(jié)果表明:艾納香具有良好的抗菌活性、抗腫瘤活性、保肝活性、抗氧化活性、抗酪氨酸激酶活性等，其中艾納香黃酮類成分具有抗氧化活性。

在植物組織中，酚酸很少以游離態(tài)形式存在，一般多與有機(jī)酸、糖以及各種酯化結(jié)合形式存在。鄭丹等［6］從艾納香地上部分分離并檢測到小麥黃素、芹菜素、木犀草素、原兒茶酸(甲酯)、咖啡酸(甲酯)、β-谷甾醇以及胡蘿卜苷等。Huang L 等［7］從艾納香地上部分得乙醇提取物中分離出香草酸、丁香酸、香豆酸、咖啡酸、和原兒茶酸，并能顯著減少老鼠血液凝固時(shí)間和尾部出血時(shí)間。

多酚類化合物的主要功能性質(zhì)是作為許多酶體系的抑制劑或激活劑、金屬螯合劑以及自由基清除劑。多酚類化合物通過酚羥基的離解和自由基途徑產(chǎn)生抗氧化作用，是醫(yī)藥、食品、化妝品中很有前景的一類天然抗氧化劑和自由基清除劑。就艾納香而言，目前研究主要集中于黃酮類成分化學(xué)分析、藥理作用等方面。有關(guān)艾納香酚酸類成分研究報(bào)道較少，未見涉及艾納香酚酸類抗氧化活性研究的報(bào)道。本研究在建立艾納香酚酸含量測定方法的基礎(chǔ)上，分析海南產(chǎn)艾納香中總黃酮、總酚酸含量與抗氧化活性相關(guān)性，進(jìn)一步比較藥材中總黃酮和總酚酸含量，以期為艾納香資源化開發(fā)與利用提供參考。

1 儀器與試藥

Multiskan? Go 型全波長酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技)，Sartarius CPA225D 電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司］，KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Beckman Coulter DU 800 紫外/可見光分光光度計(jì)［美國貝克曼庫爾特(北京)有限公司］。

維生素C(Vitamin C，Vc，純度＞99%，北京索萊寶科技有限公司)，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，純度＞97%，美國Sigma 公司)，2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，純度＞99%，西亞試劑)，6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox，純度＞97%，美國Sigma 公司)，2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，純度＞98%，西亞試劑)，蘆丁對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):153-18-4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%)，沒食子酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110831-201204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為89.9%)，福林酚試劑(上海荔達(dá)生物科技有限公司)，其余試劑均為分析純，H2O 為蒸餾水。

試驗(yàn)材料采自農(nóng)業(yè)部儋州熱帶藥用植物種質(zhì)資源圃，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院龐玉新副研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.的全草，標(biāo)本存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所標(biāo)本館。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 艾納香不同部位多酚的含量測定

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取于105 ℃干燥至恒重的沒食子酸對(duì)照品適量，加蒸餾水制成1 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

分別精密稱取艾納香嫩莖、嫩葉、功能葉樣品粉末(60 目)0.5 g，至具塞錐形瓶中，加95%乙醇溶液25 mL，稱定重量，超聲(頻率40 kHz、功率400 W)50 min，放冷。稱定重量，用95%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，稀釋至不同濃度備用。

2.1.3 測定波長的選擇

分別精密量取沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液、供試品液0.5 mL 置微量離心管中，各加Folin-Ciocalteu 試劑0.5 mL，靜置5 min 后，加入20% Na2CO3溶液1 mL，靜置10 min。以150 g 離心力離心8 min，取上清液備用。以相應(yīng)的試劑溶液為空白，在300～900 nm 波長間進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果最適檢測波長為760 nm。

2.1.4 方法學(xué)考察

我的接近并最終投身文學(xué)，近一甲子矣。在此漫漫歲月，雖無驕人成績，所幸終日矻矻，與文學(xué)相伴了一生。朋友曾與我談及一同起步的同行許多已巍然成樹，嘆息我等才情有限，始終不成氣候，最多算棵草而已，很沒勁。我同意他的比喻，卻不同意他的自卑。沒有長成樹木，長成了草，也是文學(xué)原野上的生命。而且，一粒種子，能長成一棵草，生動(dòng)地活著，其實(shí)也并不容易。說樹不是一天長成的，草又何嘗不是？天時(shí)地利人和，一樣不能少。就一個(gè)寫作者而言，不說社會(huì)歷史那么高大上的原因了，僅僅稿件的發(fā)表就不知耗費(fèi)了編輯們多少辛勞。

2.1.4.1 線性關(guān)系

分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液250、200、150、100、50 μL，置于5 mL 容量瓶中，加蒸餾水至刻度。精密量取500 μL，以下步驟按照“2.1.3”項(xiàng)下從“各加Folin-Ciocalteu 試劑0.5 mL”起，進(jìn)行操作，以相應(yīng)的試劑溶液為空白對(duì)照，在760 nm 分別測定吸光值(A)。以濃度X(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光值Y(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得Y=0.0 173X-0.0 020，r=1，線性范圍為0.0090～0.0450 mg/mL。

2.1.4.2 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，置微量離心管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定吸光值，連續(xù)測定6次。結(jié)果吸光值RSD 值為0.01%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，置微量離心管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，每隔5 min 測定其吸光值，共計(jì)60 min。結(jié)果顯示溶液在顯色后30 min 時(shí)RSD 值為0.24%，表明供試品溶液在30 min 內(nèi)較穩(wěn)定。

2.1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批艾納香藥材0.5 g，6 份，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液0.5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定吸光值。結(jié)果總酚酸含量RSD 為1.79%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4.5 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的艾納香樣品粉末(60 目)0.25 g，6 份，精密稱定。分別加入沒食子酸對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液0.5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定吸光值，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明，平均回收率為101.22%，RSD為0.66%，結(jié)果見表1，本法測定艾納香多酚含量方法準(zhǔn)確可靠。

表1 艾納香多酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 Recovery test results of total phenolic acid from B.balsamifera (n=6)

2.1.5 樣品中多酚的測定

將不同濃度的樣品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定各供試品溶液的吸光值，結(jié)果以相當(dāng)于沒食子酸(Gallic acid)的毫克數(shù)表示(mg Gallic acid/g)。

2.2 艾納香不同部位總黃酮的含量測定

供試品溶液制備同“2.1.2”項(xiàng)下所述，采用AlCl3顯色法［8］測定艾納香中不同部位總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果以相當(dāng)蘆丁(Rutin)的毫克數(shù)表示(mg Rutin/g)。

2.3 艾納香不同部位抗氧化活性的測定

2.3.1 清除DPPH 自由基的能力

精密稱取0.0150 g DPPH，無水乙醇溶解并定容至250 mL，即得DPPH 儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液配制成1.00、0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03125 g/L 的乙醇溶液，即供試品溶液。

操作步驟:將100 μL 供試品溶液和100 μL DPPH 溶液共置于96 孔板中，設(shè)置3 個(gè)平行樣品組，對(duì)照組為100 μL 的乙醇溶液和100 μL DPPH 溶液，空白組分別加入100 μL 供試品溶液和100 μL 乙醇溶液。點(diǎn)樣完畢后，室溫放置30 min，然后在517 nm 下測定其吸光值，重復(fù)測量3 次，取平均值。根據(jù)吸光值變化判斷試樣對(duì)DPPH 自由基清除能力。按照公式(1)計(jì)算其清除率，并計(jì)算出IC50。

清除率=［1-(As-Ab)/ Ac］×100% (1)

式中Ac 為對(duì)照溶液吸光度，As 為樣品溶液吸光度，Ab 為空白溶液吸光度。

2.3.2 清除ABTS 自由基的能力

分別精密稱取97.03 mg ABTS、16.76 mg K2S2O8，分別置于25 mL 棕色容量瓶中，用去離子水溶解并定容，室溫下避光靜置12～16 h，得ABTS 儲(chǔ)備液。使用前用無水乙醇稀釋至吸光值為0.70 ±0.02，得。將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液配制成1.50、1.00、0.50、0.25、0.125、0.0625 g/L 乙醇溶液，即供試品溶液。

2.3.3 Trolox 等效抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)計(jì)算

精密稱取0.0100 g Trolox 粉末，無水乙醇溶解并定容于25 mL 容量瓶中，得Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述Trolox 溶液用無水乙醇按需要稀釋為不同濃度，分別于DPPH 和ABTS 體系測定其吸光值，計(jì)算抑制率。以Trolox 濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得DPPH 體系的曲線方程Y=6.3858X+0.414，r=0.9995;ABTS 體系的曲線方程Y=0.0065X+0.0784，r=0.9996。通過上述方程計(jì)算Trolox 在兩個(gè)體系的IC50值，Trolox 的IC50值與樣品的IC50值得比值即為樣品的RACT50。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用origin8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 艾納香不同部位多酚和總黃酮含量

為了研究艾納香抗氧化活性與黃酮多酚類化合物的關(guān)系，分別采用Folin-Ciocalteu 比色法和硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測定艾納香不同部位中多酚與總黃酮的含量，見表2。由表2 可知，艾納香不同部位多酚與總黃酮含量順序與其提取液清除DPPH+·和ABTS+·的能力順序基本一致，即艾納香功能葉＞艾納香嫩葉＞艾納香嫩莖。

表2 艾納香不同部位的多酚(mg Gallic acid/g)和總黃酮(mg Rutin/g)含量及IC50(g/L)與RACT50(μmol/g)Table 2 Contents of total flavonoids (mg Rutin/g)and phenolic acid (mg Gallic acid/g)，IC50(g/L)and RACT50(μmol/g)of different parts of B.balsamifera

3.2 艾納香不同部位清除DPPH 和ABTS 自由基能力

DPPH+·是一種在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可見光波長517 nm 下具有特定的光吸收，當(dāng)試樣供給氫原子與DPPH+·的未成對(duì)電子結(jié)合時(shí)，吸光值會(huì)隨著未成對(duì)電子數(shù)量的減少而下降。通過測定最大吸收波長處吸光值的減弱程度評(píng)價(jià)試樣對(duì)DPPH+·清除能力。清除DPPH+·效果之強(qiáng)弱，即代表該試樣能提供氫(Hydrogen donor)給自由基之強(qiáng)弱。ABTS 法本質(zhì)上一種間接方法，是用來檢測物質(zhì)清除ABTS+·這種自由基的能力，與真實(shí)的氧化分解沒有關(guān)系，它只是用TEAC 值來表征測試樣品與經(jīng)氧化得到的ABTS+·反應(yīng)的能力而非阻斷該氧化過程，因此TEAC 值在概念上類似于阻斷系數(shù)，并不是直接反應(yīng)被檢物質(zhì)的活力，全面判斷一種物質(zhì)的抗氧化能力還要結(jié)合DPPH 法。ABTS 經(jīng)活性劑氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基，ABTS+·是一種較穩(wěn)定的自由基，其無水乙醇或磷酸緩沖液(PBS)呈藍(lán)綠色，其抗氧化活性物質(zhì)可抑制其產(chǎn)生并使反應(yīng)體系褪色，表現(xiàn)出吸光度降低，顏色變得越淺，表明活性物質(zhì)清除ABTS+·的能力越強(qiáng)。通過測定加入活性物質(zhì)前后在ABTS+·這種自由基的最大吸光波長下(734 nm)檢測吸光值的變化，計(jì)算出試樣對(duì)ABTS+·的清除能力。

圖2 表明，艾納香不同部位提取液對(duì)DPPH+·和ABTS+·均有一定清除能力，在較低的質(zhì)量濃度(0.0313 mg/mL)下即有較高的清除效果。在1～0.03125 g/L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨著提取物的濃度的增加，其對(duì)DPPH+·和ABTS+·清除能力逐漸增強(qiáng)，說明艾納香不同部位提取物對(duì)DPPH+·和ABTS+·的清除能力存在明顯的量效關(guān)系。在同一濃度時(shí)，艾納香功能葉清除能力最強(qiáng)，其次為嫩葉，而嫩莖最弱，兩種方法的活性測定結(jié)果趨勢一致。

3.3 Trolox 等效抗氧化能力計(jì)算

圖2 艾納香不同部位提取物對(duì)DPPH(A、C、E)和ABTS(B、D、F)自由基清除效果Fig.2 DPPH (A，C，E)and ABTS (B，D，F(xiàn))radical scavenging capacity of different parts of B.balsamifera

Trolox 是一種類似于VE的水溶性物質(zhì)，用Trolox 等同抗氧化活性值(TEAC)評(píng)價(jià)抗氧化能力，結(jié)果多表示為達(dá)到一定濃度測試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox 的濃度。以Trolox 的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)分別繪制ABTS 和DPPH 自由基清除能力測定體系的曲線方程，根據(jù)曲線方程計(jì)算Trolox 在兩個(gè)評(píng)價(jià)體系的IC50值，分別為DPPH體系36 μmol/L，ABTS 體系506 μmol/L。分別計(jì)算出艾納香不同部位提取液DPPH 體系和ABTS 體系的IC50，Trolox 的IC50與試樣的IC50比值即為試樣的RACT50。IC50和RACT50值可表示試樣抗氧化活性，IC50值越小，RACT50越大，表示此試樣的抗氧化活性越強(qiáng)，反之則相對(duì)較弱。由表2 看出，DPPH 體系和ABTS 體系趨勢一致，艾納香不同部位提取液不同評(píng)價(jià)體系抗氧化順序?yàn)?艾納香功能葉＞艾納香嫩葉＞艾納香嫩莖。

3.4 相關(guān)性分析

現(xiàn)代研究表明抗氧化活性與植物體中多酚和總黃酮含量有密切的關(guān)系［9］。因此對(duì)艾納香不同部位提取物的多酚和總黃酮含量進(jìn)行測定，并進(jìn)行相關(guān)性分析，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析尋找艾納香產(chǎn)生抗氧化活性的主要原因。結(jié)果見圖3 和表3。

如圖3A 所示，以艾納香不同部位DPPH 體系RACT50值(x)為自變量，多酚、黃酮含量(y)為因變量進(jìn)行相關(guān)性分析，得相關(guān)系數(shù)。同樣的方法獲得ABTS 體系的相關(guān)系數(shù)(圖3B)，多酚與總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)(圖3C)，DPPH 與ABTS 方法間的相關(guān)性(圖3D)。由表3 和圖3 可知，艾納香不同部位提取液的抗氧化能力與多酚和總黃酮的含量均呈正相關(guān)，其中，DPPH 體系與多酚、總黃酮含量相關(guān)系數(shù)R 分別為0.948 和0.954，ABTS 體系相關(guān)系數(shù)R 分別為0.949 和0.950，說明多酚與總黃酮是自由基清除能力的主要影響因素，多酚與總黃酮含量相關(guān)系數(shù)R 為0.999，說明艾納香多酚與總黃酮兩類有較大相似性，DPPH 與ABTS 兩種抗氧化活性測定方法間相關(guān)系數(shù)R 為0.935，說明二者方法相關(guān)性很高，可能與二者具有相似的反應(yīng)機(jī)理有關(guān)。

圖3 艾納香不同部位提取液自由基清除能力與多酚和總黃酮含量相關(guān)性［(DPPH，A)、(ABTS，B)］以及多酚與黃酮含量間(C)，DPPH 與ABTS 兩種檢測方法間(D)的相關(guān)性Fig.3 Correlations between radical scavenging capacities and total flavonoids and polyphenols contents［(DPPH，A)and(ABTS，B)］as well as between total flavonoids and polyphenols content assays (C)and between DPPH and ABTS assays (D)

表3 活性物質(zhì)與抗氧化方法間的相關(guān)性Table 3 Correlation coefficient (R)between active substances and radical scavenging capacity assays

4 結(jié)論

資料顯示，植物中酚類化合物是一種天然抗氧化劑，其中多酚和黃酮中酚羥基結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)活性氧等自由基具有很強(qiáng)的捕捉能力，這使得多酚和黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性以及清除自由基的能力，且抗氧化活性的強(qiáng)弱與其所含多酚和黃酮類成分含量的高低具有較高的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，艾納香不同部位提取液均有一定的抗氧化活性，其中功能葉對(duì)DPPH、ABTS 自由基清除效果最好，其次是嫩葉。通過相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，各部位提取液抗氧化活性與總多酚和黃酮含量之間有明顯的相關(guān)性，說明總多酚和總黃酮為艾納香提取液清除自由基作用的主要影響因素。

目前，艾納香為我國重要的民族藥之一，在黎、苗、壯等民族均有悠久的用藥歷史，上述研究結(jié)果表明艾納香含有豐富的多酚和黃酮類化合物，具備開發(fā)為抗氧化功能產(chǎn)品的價(jià)值和潛力。黃酮多酚類化合物是植物比較重要的抗氧化活性物質(zhì)，二者發(fā)揮抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)有著非常密切的關(guān)系，因此，艾納香中多酚和黃酮的種類、結(jié)構(gòu)以及與抗氧化活性的關(guān)系尚有待進(jìn)一步闡釋。

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