檳榔多糖的抗氧化活性及其對細胞內(nèi)氧化損傷抑制作用的研究

唐敏敏等

摘 要 研究了檳榔多糖粗提物（ASP）的抗氧化活性及其對人皮膚成纖維細胞（HSF）內(nèi)氧化損傷的抑制作用。結果表明：利用超聲波輔助法提取的檳榔子多糖經(jīng)初步去雜質(zhì)后，具有良好的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）清除能力、二價鐵螯合能力和三價鐵還原力。在對HSF細胞內(nèi)氧化損傷的抑制作用研究中，當過氧化氫（H2O2）處理濃度為150 μmol/L、ASP添加濃度為20 μg/mL時，HSF細胞存活率上升至93.15%，與對照組差異不顯著（p<0.05）；當短波紫外線照射強度為100 μW/cm2、照射時間為3.5 h、ASP添加量為20 μg/mL 時，HSF細胞存活率上升至82.92%，與對照組差異不顯著（p<0.05）。因此，ASP具有抑制H2O2和短波紫外線處理對HSF細胞造成的氧化損傷的作用。

關鍵詞 檳榔多糖；抗氧化；抗細胞內(nèi)氧化損傷

中圖分類號 S792.91 文獻標識碼 A

Abstract The in vitro antioxidant activities and protective effects on human skin fibroblasts（HSF） of crude polysaccharides from Areca catechu L. seed were evaluated. The initially purified ASP had good DPPH radical scavenging acitivity，ferrous ions chelating capacity and strong reducing power. Cell culture results indicated that HSF（damaged by H2O2 or UV C） treated with ASP exhibited better cellular morphology and higher cell variability compared with the negative control group，and the protective effects were stronger with a supplemented ASP dose in the experimental range.

Key words Polysaccharides from Areca catechu L. seed；Antioxidant activities；Protective effects

檳榔（Areca catechu L.）是棕櫚科檳榔屬植物，為多年生常綠喬木，廣泛分布于中非、南亞和東南亞等國家。中國也是重要的檳榔產(chǎn)地之一，主要集中在海南、臺灣、廣東等省份。檳榔果中含檳榔油、生物堿、多酚、色素等多種化學物質(zhì)，具有瀉氣消水、殺蟲去積[1]、抑菌消炎[2]、殺精抑排卵[3]、保護肝臟[4]等藥理作用，入藥歷史悠久。

檳榔是海南省熱帶作物中僅次于橡膠的第二大經(jīng)濟作物。然而中國的檳榔加工技術水平目前處于初級加工階段，缺乏高附加值產(chǎn)品，嚴重影響了檳榔產(chǎn)業(yè)的收益。另一方面，有關于檳榔致癌的研究報道[5]，即對檳榔的褒貶看法不一。因此，探索檳榔的功能成分及其生理活性，科學地評價檳榔的生理功能作用，對促進檳榔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

多糖是廣泛存在于動物、植物和微生物中的一類碳水化合物，因其具有獨特的物理化學特性和生物活性而越來越受到人們的關注和重視。迄今為止，大量研究結果表明多糖具有廣泛的藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)[6]、抗腫瘤[7]、防紫外線[8]、降低血糖血脂、抗氧化、抑制潰瘍、造血[9]等。目前，關于檳榔活性成分的研究主要集中在生物堿、多酚、色素等方面，而關于檳榔多糖的研究鮮有報道。

筆者主要研究ASP的體外抗氧化活性及其對人體皮膚成纖細胞內(nèi)氧化損傷的抑制作用，以期為檳榔的精深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及預處理 5月齡的檳榔（Areca catechu L cv. Reyan No.1）果實摘自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所檳榔種質(zhì)基地，去殼后的種子經(jīng)冷凍干燥后，保存于干燥器中備用（1個月內(nèi)使用）。

1.1.2 藥品和試劑 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、Ferrozine試劑購自Sigma公司；高糖改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；其他分析純試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 超聲波細胞破碎儀（型號：XO-650D）均購自南京先歐儀器制造有限公司；紫外可見分光光度計、二氧化碳培養(yǎng)箱（型號：WJ-1851）均購自上海三騰儀器有限公司；全自動熒光免疫分析儀（型號：VarioskanFlash）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ASP的制備 將干燥的檳榔種子磨碎，過200目篩后置于燒杯中，加入15倍體積的蒸餾水，于超聲波細胞破碎儀內(nèi)進行多糖提取，提取超聲波功率為400 W，提取時間為8 min，于9 000 r/min條件下離心10 min，重復提取2次（在冰浴條件下提取以保持提取系統(tǒng)的溫度在55 ℃以下）；合并上清液，通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其濃縮至原來體積的1/4，加入4倍體積的無水乙醇沉淀過夜；所得到的沉淀用無水乙醇、丙酮和乙醚進行清洗，加入少量的去離子水進行凍干后得到ASP，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檳榔多糖抗氧化能力測定 （1）ASP對DPPH·的清除率測定：參照文獻[10]的方法，分別吸取2 mL不同濃度的ASP溶液與等體積的0.14 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液于試管中，混勻，室溫下暗處放置30 min后，在517 nm波長下測定吸光值。以水溶性維生素C（Vc）作陽性對照。DPPH自由基清除率按照下列公式計算：

清除率/%=（1-Asample 517/Acontrol 517）×100

（2）ASP對三價鐵離子的還原力測定：參照文獻[11]的方法，稍有改動。于0.5 mL不同濃度的ASP溶液中分別加入1 mL pH為 6.8的0.2 mol/L磷酸緩沖液和 2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，于50 ℃水浴中反應20 min；加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液終止反應后，加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵顯色，穩(wěn)定10 min；于700 nm波長下測定吸光值。吸光值越大，還原力越強。以Vc作陽性對照。

（3）ASP對二價鐵離子螯合力測定：參照文獻[11]的方法，略有改動。分別于1 mL 不同濃度的ASP溶液中加入0.1 mL 300 μmol/L的二氯亞鐵溶液，反應30 s后，加入 0.1 mL 5 mmol/L Ferrozine 溶液，混勻后室溫反應10 min，于562 nm處測定吸光值。以乙二烯四乙酸二鈉（EDTA-2Na）作陽性對照。

螯合率/%=（1-Asample 562/Acontrol 562）×100

1.2.3 ASP對HSF細胞內(nèi)氧化損傷的保護作用 （1）HSF的培養(yǎng)：將HSF細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2，溫度37 ℃，飽和濕度。

（2）對過氧化氫誘導的HSF細胞內(nèi)氧化損傷的保護作用：采用文獻[12]的方法，稍有改動。當細胞處于對數(shù)生長期時，用0.25%的胰酶消化后再用吸管吹打成單細胞懸液，以1×104個/mL的密度接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)。實驗分為對照組、陰性對照組、ASP保護組。對照組：不做任何處理，培養(yǎng)24 h；陰性對照組：用含終濃度為150 μmol/L 的H2O2培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；ASP保護組：用含150 μmol/L H2O2及不同濃度ASP（5、10、20 μg/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，采用MTT法測定細胞存活率。

（3）對短波紫外線誘導的HSF細胞內(nèi)氧化損傷的保護作用：采用文獻[13]的方法，稍有改動。當細胞處于對數(shù)生長期時，用0.25%的胰酶消化后再用吸管吹打成單細胞懸液，以2×105個/mL的密度接種于35 mm的細胞培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)。實驗分為正常對照組、陰性對照組、ASP保護組（ASP添加濃度分別為5、10、20 μg/mL）。實驗分組后，吸除各細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用PBS沖洗一次后加入700 μL PBS覆蓋底面以避免干燥。陰性對照組和ASP保護組于18 W紫外燈下照射3.5 h，照射強度為100 μW/cm2；正常對照組不經(jīng)過紫外照射。紫外照射結束后，采用MTT法測定各組細胞存活率。

（4）細胞存活率的測定：采用MTT法[12]，略有改動。待分組處理的細胞結束培養(yǎng)后，加入5 mg/mL的MTT 20 μL，于37 ℃孵育4 h，吸除上清液，加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解，于550 nm波長下測定各孔吸光度（A）。假設正常對照組的細胞存活率為100%。

細胞存活率/%= Asample/Acontrol×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

體外抗氧化活性試驗設3個重復，細胞存活率實驗設8個重復，實驗結果表述用平均值±標準偏差，采用 SPSS 16.0中的Duncan 法進行顯著性分析，用Excel 2007作圖。

2 結果與分析

2.1 ASP的體外抗氧化作用

2.1.1 對DPPH·的清除活性 如圖1所示，ASP對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加而逐漸升高，而Vc的濃度為20 μg/mL時，DPPH自由基清除率基本達到100%。通過線性回歸分析可知，在0～70 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，ASP對DPPH·的清除率與濃度呈線性正相關（y=1.08x+0.24，R2=0.998 0）；在0～7 μg/mL范圍內(nèi)，Vc對DPPH·的清除率與濃度也呈線性正相關（y=8.27x+2.94，R2=0.994 9）。ASP的EC50值為46.26 μg/mL，換算成Vc當量為 0.12 μg/mL，說明ASP對DPPH·的清除能力良好。

2.1.2 對三價鐵的還原力 如圖2所示，在實驗測定范圍內(nèi)，ASP和Vc對三價鐵的還原力均具有濃度依賴性，隨著濃度的升高而逐漸增強。通過線性回歸分析，得到兩者對三價鐵還原力的線性濃度范圍分別為0～200、0～100 μg/mL，線性公式分別為y=0.003 1 x+0.056 5、y=0.007 3 x+0.018 2，R2分別為0.994 9、0.998 6。實驗結果表明ASP具有一定的三價鐵還原能力。

2.1.3 二價鐵離子螯合力 圖3列出了ASP和EDTA-2Na對二價鐵離子的螯合能力。在實驗測定范圍內(nèi)，二價鐵離子的螯合能力隨ASP濃度的增加呈線性升高趨勢，線性公式為y=0.390 9x+11.772（R2=0.994 9）。而在0～9 μg/mL范圍內(nèi)，EDTA-2Na對二價鐵離子的螯合能力也與其濃度呈正相關（y=10.451 0x+8.495 4，R2=0.997 4）。通過計算得出，ASP的EC50值為97.79 μg/mL，換算成EDTA-2Na當量為 0.04 μg/mL。

2.2 ASP對HSF 細胞內(nèi)氧化損傷的保護作用

2.2.1 對過氧化氫誘導的HSF 細胞內(nèi)氧化損傷的保護作用 為建立H2O2對HSF細胞的氧化損傷模型，采用150 μmol/L的H2O2處理HSF細胞24 h，結果如圖4所示。在倒置顯微鏡下，正常的人皮膚成纖維細胞為梭狀，細胞形態(tài)規(guī)則、飽滿。陰性對照組的細胞被H2O2損傷，形態(tài)發(fā)生變化，逐漸變圓、皺縮；而經(jīng)ASP保護后，損傷的形態(tài)逐漸恢復正常，當ASP濃度為20 μg/mL時，被損傷細胞已接近正常細胞的形態(tài)（圖4-A）。細胞存活率實驗結果表明，用H2O2處理HSF細胞24 h后細胞存活率明顯降低，僅為正常對照組的48.21%，而添加ASP能明顯提高被H2O2損傷的HSF細胞的存活率，而且與ASP濃度呈現(xiàn)量效關系。ASP的添加濃度為5 μg/mL時，細胞存活率為69.68%，顯著高于陰性對照組（p<0.05）；當ASP的濃度分別增加至10、20 μg/mL時，細胞存活率均增長至80%以上（圖4-B），并且與對照組無顯著差異（p<0.05）。這表明ASP可以抑制H2O2誘導的HSF細胞內(nèi)氧化損傷。

2.2.2 對短波紫外線誘導的HSF細胞內(nèi)氧化損傷的保護作用 采用短波紫外線誘導細胞內(nèi)氧化損傷，研究ASP對HSF細胞的保護作用，結果如圖5所示。由圖5-A可知，ASP可以在一定程度上保護短波紫外線處理的HSF細胞微觀形態(tài)。在細胞存活率實驗中，經(jīng)短波紫外線照射的HSF細胞存活率降低至正常組的48.18%。當ASP添加量為20 μg/mL時，HSF細胞存活率上升至82.92%，與正常對照組無顯著性差異（p<0.05）；而低濃度（5、10 μg/mL）ASP不能顯著改善存活率（圖5-B）。結果表明一定濃度的ASP可以抑制短波紫外線誘導的HSF細胞內(nèi)氧化損傷。

3 討論與結論

活性氧代謝失調(diào)是自由基大量產(chǎn)生的主要途徑。自由基生物學研究認為，許多疾病的發(fā)生與自由基導致的大分子功能障礙如蛋白質(zhì)修飾、脂質(zhì)過氧化以及DNA損傷等有關[14]。目前有多種方法均可評價某種化學成分是否具有抗氧化性。本研究通過DPPH自由基清除能力、二價鐵螯合力、三價鐵還原力的強弱對ASP的體外抗氧化能力進行了評價，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗氧化活性，這與其他多種植物中多糖的研究結果比較一致[15-17]。有研究表明，還原力的強弱與抗氧化劑中含有的還原酮有關，因為還原酮可以貢獻氫自由基，打破原有的自由基鏈，進而發(fā)揮抗氧化作用；還原酮還可以與一些過氧化物的前體發(fā)生反應，阻止過氧化反應的進行[18]。二價鐵離子螯合能力則與分子結構中含有的-OH、-SH、-COOH、-PO3H2、CO、-NR2、-S-和-O-等官能團有關，因此可以推斷ASP中含有以上一種或幾種官能團。

H2O2和紫外輻射是重要的氧化應激源，進入人體后，可打破內(nèi)部的氧化-還原平衡，超氧陰離子自由基、羥基自由基、氮氧自由基和單線態(tài)氧等活性氧大量表達，引起脂質(zhì)過氧化、DNA損傷等，進而導致機體病變[19]。在細胞存活率實驗中，ASP能夠改善HSF細胞形態(tài)、顯著提高細胞存活率，有效地抑制H2O2和短波紫外線對該類細胞造成的氧化損傷。經(jīng)分析可知，ASP能夠抑制細胞內(nèi)的氧化損傷可能與檳榔多糖具有良好的抗氧化性有關。另一方面，多糖及其復合物的生物活性大多與其化學組成、分子量、官能團的位置、糖苷鍵的類型及提取分離的方法等因素有關[19]，所以關于ASP的結構及其發(fā)揮抗氧化作用的機理還需要進一步深入研究。

參考文獻

[1] 張渝渝， 楊大堅， 張 毅. 檳榔的化學及藥理研究概況[J]. 重慶中草藥研究， 2014（1）： 37-41， 44.

[2] Khan S， Mehmood M H， Ali A N A， et al. Studies on anti-inflammatory and analgesic activities of betel nut in rodents[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2011， 135（3）： 654-661.

[3] Shrestha J， Shanbhag T， Shenoy S， et al. Antiovulatory and abortifacient effects of Areca catechu（betel nut） in female rats[J]. Indian Journal of Pharmacology， 2010， 42（5）： 306-311.

[4] Pithayanukul P， Nithitanakool S， Bavovada R. Hepatoprotective potential of extracts from seeds ofAreca catechuand nutgalls of Quercus infectoria[J]. Molecules， 2009， 14（12）： 4 987-5 000.

[5] Li W C， Lee P L， Chou I， et al. Molecular and cellular cues of diet‐associated oral carcinogenesis-with an emphasis on areca-nut-induced oral cancer development[J]. Journal of Oral Pathology & Medicine， 2014， DOI： 10. 1111/jop. 12171.

[6] Wijesekara I， Pangestuti R， Kim S K. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae[J]. Carbohydrate Polymers， 2011， 84（1）： 14-21.

[7] Zong A Z， Cao H Z， Wang F S. Anticancer polysaccharides from natural resources： A review of recent research[J]. Carbohydrate Polymers， 2012， 90（4）： 1 395-1 410.

[8] Widel M， Krzywon A， Gajda K， et al. Induction of bystander effects by UVA， UVB， and UVC radiation in human fibroblasts and the implication of reactive oxygen species[J]. Free Radical Biology and Medicine， 2014， 68： 278-287.

[9] Jin M， Zhao K， Huang Q， et al. Isolation， structure and bioactivities of the polysaccharides from Angelica sinensis （Oliv.）Diels： A review[J]. Carbohydrate Polymers， 2012， 89（3）： 713-722.

[10] Liu D M， Sheng J W， Li Z J， et al. Antioxidant activity of polysaccharide fractions extracted from Athyrium multidentatum （Doll.）Ching[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2013， 56： 1-5.

[11] Jiang C X， Xiong Q P， Gan D， et al. Antioxidant activity and potential hepatoprotective effect of polysaccharides from Cyclina sinensis[J]. Carbohydrate Polymers， 2013， 91（1）： 262-268.

[12] Giampieri F， Alvarez-Suarez J M， Mazzoni L， et al. Polyphenol-rich strawberry extract protects human dermal fibroblasts against hydrogen peroxide oxidative damage and Improves mitochondrial functionality [J]. Molecules， 2014， 19（6）： 7 798-7 816.

[13] Widel M， Krzywon A， Gajda K， et al. Induction of bystander effects by UVA， UVB， and UVC radiation in human fibroblasts and the implication of reactive oxygen species[J]. Free Radical Biology and Medicine， 2014， 68： 278-287.

[14] 張桂芝， 耿 莎， 楊海燕， 等. 植物抗氧化成分的研究進展[J]. 食品科學， 2008， 28（12）： 551-553.

[15] Zhang Z F， Lü G Y， Pan H J， et al. Antioxidant and hepatoprotective potential of endo-polysaccharides from Hericium erinaceus grown on tofu whey[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2012， 51（5）： 1 140-1 146.

[16] Wu G H， Hu T， Li Z Y， et al. In vitro antioxidant activities of the polysaccharides from Pleurotus tuber-regium （Fr.） Sing.[J]. Food Chemistry， 2014， 148： 351-356.

[17] Fan J L， Wu Z W， Zhao T H， et al. Characterization， antioxidant and hepatoprotective activities of polysaccharides from Ilex latifolia Thunb[J]. Carbohydrate Polymers， 2014： 101， 990-997.

[18] Kong F L， Zhang M W， Liao S T， et al. Antioxidant activity of polysaccharide-enriched fractions extracted from pulp tissue of Litchi Chinensis sonn[J]. Molecules， 2010， 15（4）： 2 152-2 165.

[19] 宗萬松. 環(huán)境氧化應激誘發(fā)蛋白質(zhì)（多肽）氧化損傷評價新方法的研究[D]. 濟南： 山東大學， 2011.