APX基因植物表達雙元載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化劍麻

覃海燕等

摘 要 劍麻是中國熱帶地區(qū)最重要的麻類經(jīng)濟作物。劍麻H.11648是中國唯一的當家品種，此品種雖高產(chǎn)但易感斑馬紋病，而現(xiàn)有的化學(xué)農(nóng)藥防效差且病原菌易產(chǎn)生抗性。為了培育出劍麻抗病新品種，以Pcambia3300為基礎(chǔ)質(zhì)粒，構(gòu)建由35S驅(qū)動的APX基因的植物表達載體Pcambia3300-35S-APX-nos，再通過農(nóng)桿菌EHA105將其導(dǎo)入劍麻中，經(jīng)PCR擴增后電泳檢測分析，結(jié)果表明外源基因已整合到受體植物基因組中。

關(guān)鍵詞 劍麻；APX基因；斑馬紋?。晦D(zhuǎn)化

中圖分類號 S563.8 文獻標識碼 A

Abstract Sisal is one of the most important cash crops in the tropical areas of China. Sisal H. 11648 is Chinas only variety dorminantly planted. The variety is of high yield but susceptable to zebra grain， and the control effect of chemical pesticides is poor and the pathogens are prone to resistance. In order to breed new sisal disease-resistant varieties， Agrobacterium-mediated APX gene transformation of sisal was tried. On the basis of Pcambia 3300 plasmid， an APX'S plant expression vector Pcambia-3300-APX which driven by 35S was built and transformed to sisal by agrobacterium EHA105. PCR amplification and electrophoresis detection analysis showed that the exogenous gene was integrated into the receptor plant genome.

Key words Sisal；APX；Zebra disease；Transformation

龍舌蘭科植物共有21屬約670種，龍舌蘭麻系是龍舌蘭科所屬單子葉植物的統(tǒng)稱，俗稱劍麻，英文名Sisal。 劍麻主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。中國是劍麻的主要生產(chǎn)國之一，中國現(xiàn)在的主栽品種為11648號（Agave hybrid NO.11648，簡寫為 H.11648）。劍麻H.11648是中國從國外引進的雜交種，雖高產(chǎn)但易感斑馬紋病。劍麻斑馬紋病是危害劍麻的主要病害之一，由煙草疫霉（Phytophthora nicotianae var. parasitica）引起。1961年坦桑尼亞首先發(fā)現(xiàn)此病，中國1970年首次在廣東省東方紅農(nóng)場出現(xiàn)此病，1973年暴發(fā)流行，此后持續(xù)流行，造成嚴重損失。因煙草疫霉對現(xiàn)存的藥劑能夠很快的產(chǎn)生耐藥性，目前生產(chǎn)上正在使用的殺菌劑很難有效防治斑馬紋病，因此急需選育劍麻抗病新種質(zhì)。劍麻一生只開一次花，開花結(jié)果后死亡，其營養(yǎng)生長周期長，一般為10 a，有的甚至長達15 a以上，且花期不一致、花粉不易貯藏、種子發(fā)芽率低（一般在10%左右）、F1育性差等特點，從而導(dǎo)致近幾十年來通過雜交育種、輻射育種等方法雖然也育成了一些品種，但還未超越H.11648?；蚬こ逃N能夠打破物種間的界限，將其他物種中優(yōu)良的基因?qū)雱β橹袑ζ溥M行定向改良。

抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase， 以下簡寫為APX）廣泛存在于各種植物體中。植物體無論是在正常的生物代謝還是在受到生物脅迫或非生物脅迫時都會產(chǎn)生大量的過氧化物，過氧化物若不及時清除會造成植物細胞膜和葉綠體的損傷，甚至造成植物死亡。抗壞血酸過氧化物酶通過清除植物體中的過氧化物來提高植物對生物和非生物脅迫的抵抗能力。張怡[1]通過突變篩選得到APX基因超表達植株，表明APX基因的超表達能夠提高植物抵抗環(huán)境脅迫的能力。程林梅等[2]和孫衛(wèi)紅等[3]通過將APX基因轉(zhuǎn)入菊苣和煙草中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性提高。孫宏麗[4]通過構(gòu)建反義載體并轉(zhuǎn)入煙草中，得到的轉(zhuǎn)基因植株抗氧化能力降低。蔣明等[5]通過對青花菜APX基因進行RT-PCR分析，結(jié)果表明APX基因的表達受霜霉病菌、水楊酸和NaCl誘導(dǎo)。Sarowar等[6-7]將來自于胡椒葉片的抗壞血酸過氧化物酶基因（ascorbate peroxidase-like 1）導(dǎo)入煙草，極大地提高了植物抵抗煙草疫霉的能力， 并在次年發(fā)現(xiàn)番茄中的過氧化物酶基因能夠抵抗卵菌型的病原體。

鑒于此，本實驗擬通過將胡椒葉片中的APX基因插入Pcambia3300載體并轉(zhuǎn)入劍麻中，從而獲得既抗劍麻斑馬紋病，又抗除草劑的植株。

1 材料與方法

1.1 材料

Pbi121表達載體、Pcambia3300表達載體和農(nóng)桿菌EHA105均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所張樹珍實驗室提供，Puc57-APX由本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶為fragment公司產(chǎn)品，DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品，其他產(chǎn)品均由市售分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 Pcambia3300-APX表達載體的構(gòu)建 （1）pbi121-APX的構(gòu)建：設(shè)計引物對5′- GCTCTAGAGCA

CGAGGTCGGTTCTCTCTC-3′和5′-TCGAGCTCCCTC

CAAAGTATGGGTATC-3′（引物中下劃線部分表示XbaⅠ和SacⅠ酶切位點），以Puc57-APX載體為模板，PCR擴增獲得目的基因APX。上述PCR產(chǎn)物用XbaⅠ和SacⅠ進行雙酶切，并利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收片段。pbi121質(zhì)粒用XbaⅠ和SacⅠ進行雙酶切，電泳后進行膠回收（pbi121回收大片段）。將上述2個片段用T4 DNA連接酶進行連接，熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，挑取單克隆進行擴繁，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，挑取陽性克隆送公司測序。

（2）Pcambia3300-35S-APX-nos表達載體的構(gòu)建：設(shè)計引物對5′-ATCCCCGGGCATGGAGTCAAA

GATTCAAATAGAG-3′和5′-CCCAAGCTTCCCGATC

TAGTAACATAGATGACAC-3′（引物中下劃線部分表示HindⅢ和SmaⅠ酶切位點），以pbi121-apx載體為模板，PCR擴增獲得35S-APX-nos的全長。將上述PCR產(chǎn)物和Pcambia3300分別用HindⅢ和SmaⅠ進行雙酶切，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收35S-APX-nos片段（約2 kb），Pcambia3300回收片段（約8.4 kb），將2個回收片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接，熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，挑取單克隆進行擴繁，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，挑取陽性克隆送公司測序。

（3）表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌：將重組表達載體Pcambia3300-35S-APX-nos經(jīng)液氮凍融法轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105中，用含有50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L鏈霉素的YEP平板進行篩選，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證，顯示陽性的菌液經(jīng)-70 ℃液氮速凍保存，備用。

1.2.2 劍麻的遺傳轉(zhuǎn)化 （1）轉(zhuǎn)化菌液的制備：將含有Pcambia3300空載體的農(nóng)桿菌從-70 ℃液氮速凍中取出涂布于含有抗生素（50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L鏈霉素）YEP平板進行活化，2 d后挑取單菌落接種于含有抗生素（50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L鏈霉素）YEP液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為對數(shù)期時備用。

（2）影響劍麻遺傳轉(zhuǎn)化的因素：取劍麻組培苗的莖尖，放入劍麻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生成愈傷。將愈傷切成0.5 cm3大小，預(yù)培養(yǎng)3 d（暗培養(yǎng)）后，在農(nóng)桿菌菌液（菌液OD為0.4）中浸泡15 min。取出外植體用濾紙吸干多余的菌液，置于共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3 d（暗培養(yǎng)）。將轉(zhuǎn)化后的劍麻愈傷組織經(jīng)無菌水清洗3次，再用含有200 mg/L的timentin的無菌水清洗3次。轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中篩選3輪（每輪15 d），最后統(tǒng)計抗性愈傷率。所有培養(yǎng)基均經(jīng)過121 ℃高壓滅菌20 min，且抗生素通過無菌22 μm濾膜過濾除菌（表1）。

對于轉(zhuǎn)化的影響因素，設(shè)計了7組試驗：①預(yù)培養(yǎng)時間：1、2、3、4 d；②農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時間和抗壞血酸的影響：設(shè)計了3因子3因素的正交試驗（表2）；③表面活性劑的影響：在感染液中添加0、0.01%、0.1%、1%（V/V）的tween20；④共培養(yǎng)溫度：19、22、25、28 ℃；⑤共培養(yǎng)時間：2、3、4、5 d；⑥干燥處理：侵染后直接放入共培養(yǎng)基中，在超凈工作臺中處理30、60 min后，再放入共培養(yǎng)基中培養(yǎng)；⑦濾紙的使用：在共培養(yǎng)基上加濾紙和不加濾紙2種處理。其它所有劍麻組培過程均在28 ℃，光照強度3，光照時間16 h/d條件下進行。

（3）劍麻的遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化菌液的制備：將含有APX基因的農(nóng)桿菌從-70 ℃中取出，涂布于含有抗生素（50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L鏈霉素）YEP平板進行活化，2 d后挑取單菌落接種于含有抗生素（50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L鏈霉素）YEP液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5時備用。再按1.2.2（2）優(yōu)化的劍麻遺傳轉(zhuǎn)化體系，用含有APX基因的農(nóng)桿菌侵染劍麻愈傷組織100個，得到分化的小苗。

（4）抗性植株的PCR：提取再生植株葉的總DNA并以其作為模板，利用引物1（5′-ATCCCCGGG

CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAG-3′）和引物2（5′-CCCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC

AC-3′）進行PCR擴增，PCR程序為：2xPCRmix 12.5 μL，引物1（10 μm）和引物2（10 μm）各位1.0 μL，Template 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25.0 μL。最后擴增得到的片段大小為1 102 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Pcambia3300-35S-APX-nos載體的酶切驗證

劍麻葉片頂端帶刺，田間除草不便；將APX基因插入PCAMBIA3300表達載體（含Bar基因）中（圖1），從而得到既抗病又抗除草劑的劍麻植株。

由圖2可知，重組pbi121-APX載體經(jīng)PCR擴增和雙酶切驗證，結(jié)果顯示，APX基因已插入到pbi121載體中。由圖3可知，重組Pcambia3300-35S-APX-nos載體經(jīng)PCR擴增和雙酶切驗證，結(jié)果顯示，35S-APX-nos片段已插入到Pcambia3300質(zhì)粒中。

2.2 表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的雙酶切驗證

提取轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的質(zhì)粒進行雙酶切驗證，結(jié)果見圖4，說明該重組表達載體已成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105中。

2.3 轉(zhuǎn)化影響因素

2.3.1 預(yù)培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響 由圖5可知，預(yù)培養(yǎng)2 d時，得到的抗性愈傷率最高。

2.3.2 農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時間和抗壞血酸對轉(zhuǎn)化的影響 由圖6可知，在農(nóng)桿菌菌液濃度OD值0.5、侵染時間25 min和抗壞血酸50 mg/L時，得到的抗性愈傷率最高。

2.3.3 表面活性劑對轉(zhuǎn)化的影響 由圖7可知，當在感染液中加入0.10%的Tween20時，得到的抗性愈傷率最高。

2.3.4 共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化的影響 由圖8可知，當共培養(yǎng)溫度為22 ℃時，抗性愈傷率最高。

2.3.5 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響 由圖9可知，當共培養(yǎng)時間為4 d時，得到的抗性愈傷率最高。 2.3.6 干燥處理對轉(zhuǎn)化的影響 由圖10可知，當干燥處理為30 min時，得到的抗性愈傷率最高。

2.3.7 濾紙的使用對轉(zhuǎn)化的影響 由圖11可知，共培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基上加上濾紙可得到較高的抗性愈傷率。

2.4 劍麻的遺傳轉(zhuǎn)化 用農(nóng)桿菌侵染劍麻愈傷100個，結(jié)果得到38個抗性愈傷，其轉(zhuǎn)化率為38%；得到抗PPT的小苗51株，經(jīng)PCR擴增驗證，含APX基因的陽性植株有19株，說明APX基因的陽性轉(zhuǎn)化率為37.25%（圖12）。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR驗證

部分轉(zhuǎn)基因劍麻的PCR驗證見圖13，結(jié)果顯示APX基因已轉(zhuǎn)入劍麻中。

3 討論與結(jié)論

已有研究結(jié)果表明，外植體進行適當時間的預(yù)培養(yǎng)有利于提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率[10-12]。共培養(yǎng)是植物轉(zhuǎn)化最關(guān)鍵的時期，T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合均在該時期完成[13]。如果共培養(yǎng)時間短，外源基因不能有效的整合到植物中；如果過長，則會因農(nóng)桿菌的過度生長而導(dǎo)致外植體死亡或后期不能很好的去除農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌在侵染外植體時會造成外植體的過敏反應(yīng)，從而褐化，甚至死亡，在侵染液和共培養(yǎng)基中加入適當濃度的Vc能夠有效的降低農(nóng)桿菌對外植體造成的傷害[14]。在共培養(yǎng)時，在共培養(yǎng)基上加上濾紙能夠有效的抑制農(nóng)桿菌的生長，且有利于后期農(nóng)桿菌的去除[15-16]。已有研究結(jié)果表明，對于劍麻愈傷的遺傳轉(zhuǎn)化，外植體預(yù)培養(yǎng)3 d、OD600為0.6、侵染10 min時，獲得的轉(zhuǎn)化率為23%[9]。本實驗在前人的研究基礎(chǔ)上，系統(tǒng)的優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)劍麻遺傳轉(zhuǎn)化的條件，從而得到了更高的轉(zhuǎn)化率[9]。

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