一例I型鴨病毒性肝炎及其高免卵黃抗體的制備

王蕾 劉玉慶 宋道禎 付石軍 常維山

摘 ?要：對(duì)山東省蒙陰縣某疑似鴨肝炎發(fā)病鴨肝臟進(jìn)行超薄片電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)兩種不同的病毒顆粒，RT-PCR鑒定，確診發(fā)病鴨為I型鴨病毒性肝炎和禽流感混合感染。用該鴨肝炎毒株接種易感雛鴨，取病死鴨肝臟，制備組織滅活苗，并加以不同的疫苗佐劑，設(shè)置蜂膠組、黃芪組及不加佐劑的對(duì)照組三組。按照免疫程序免疫高產(chǎn)蛋雞，收集高免蛋。通過(guò)中和試驗(yàn)對(duì)三組卵黃抗體的效價(jià)進(jìn)行了測(cè)定，選擇效價(jià)較高的卵黃抗體將其應(yīng)用于臨床發(fā)病雛鴨的治療。

關(guān)鍵詞：鴨病毒性肝炎;混合感染;卵黃抗體

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.325.3 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2015）06-0013-04

鴨病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（DHV）引起雛鴨的一種高度致死性、急性傳染病，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。本病多發(fā)生于3周齡內(nèi)的雛鴨，1周齡左右的雛鴨最易發(fā)生。病死鴨多呈角弓反張樣外觀，其肝臟常有特征性的出血性病變，以肝炎為其主要特征。2014年3月，山東蒙陰某肉鴨場(chǎng)7日齡雛鴨出現(xiàn)大批死亡，病死率高達(dá)80%，病死鴨呈現(xiàn)角弓反張，剖檢可見(jiàn)肝臟明顯的出血點(diǎn)。

1 ?材料

1.1 ?病料來(lái)源 ?山東蒙陰縣疑似鴨肝炎病死雛鴨肝臟。

1.2 ?主要試劑 ?反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV），Promega公司生產(chǎn);反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（RNase Inhibitor）、dNTP、rTaq DNA聚合酶、DNA marker，TaKaRa公司生產(chǎn);Trizol，invitrogen公司生產(chǎn)。

2 ?方法

2.1 ?肝組織電鏡標(biāo)本制備及觀察 ?取活的發(fā)病雛鴨的肝臟切成小薄片，存放于盛有2.5% 戊二醛的瓶中，4℃冰箱固定2h以上。取出切片0.1M磷酸緩沖液進(jìn)行漂洗，漂洗3次，每次45min。用1%鋨酸進(jìn)行后固定，1h左右，再漂洗。脫水、包埋聚合后制成超薄切片，用飽和醋酸鈾染色30min，檸檬酸鉛染色5～8min。H-7000型透射電子顯微鏡對(duì)肝臟超薄片進(jìn)行觀察。

2.2 ?雞胚半數(shù)致死量測(cè)定（ELD50） ?將病料加生理鹽水勻漿后取上清，反復(fù)凍融3次，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，0.2ml/胚經(jīng)尿囊腔接種到9日齡的雞胚5枚，另取2枚雞胚接種滅菌生理鹽水0.2ml/胚作對(duì)照，置37℃溫箱培養(yǎng)，并逐日觀察記錄結(jié)果，收集死亡雞胚尿囊液。

將有明顯病變的尿囊液用雙抗生理鹽水進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋?zhuān)缓笥每讖綖?.22μm的一次性濾器過(guò)濾，分別取10-2～10-8 7個(gè)稀釋梯度的病毒液接種到9日齡的雞胚尿囊腔中，0.2ml/胚，每個(gè)梯度接種5個(gè)雞胚，封口，并做好標(biāo)記，在37℃的溫箱中孵化，每12h照一次雞胚，24h內(nèi)死亡的雞胚棄掉，記錄5d內(nèi)胚胎死亡時(shí)間及數(shù)量。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算雞胚半數(shù)致死量ELD50。

2.3 ?混合感染的RT-PCR診斷

2.3.1 ?引物設(shè)計(jì) ?根據(jù)Genbank已發(fā)表的 DHV-I 基因組序列和禽流感病毒核蛋白基因（NP）序列，利用DNAstar生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)合成并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成兩對(duì)鑒定引物，引物序列為：

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2.3.2 ?病毒RNA的提取 ?參照Trizol法提取，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3.3 ?RT-PCR反應(yīng) ?反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按20μl體系進(jìn)行，反應(yīng)條件為42℃ 20min，85℃ 5s。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)以25μl反應(yīng)體系進(jìn)行：10×Buffer緩沖液2.0μl，dNTP 2.0μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板1μl，rTaqDNA 聚合酶0.5μl，加水至25μl。

鴨肝炎病毒RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋合?4℃4min預(yù)變性，再進(jìn)行94℃ 45s，54℃ 45s，72℃ 45s 的反應(yīng)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，于4℃結(jié)束反應(yīng)。

禽流感病毒PCR反應(yīng)條件為：先94℃ 5min 預(yù)變性，再進(jìn)行94℃ 1min，54℃ 45s，72℃ 45s 的反應(yīng)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，于4℃結(jié)束反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行鑒定。

2.4 ?I型鴨肝炎組織滅活苗的制備

2.4.1 ?病料處理 ?無(wú)菌取病死雛鴨肝臟作為材料，并去除被膜、結(jié)締組織及膽囊。將病料稱(chēng)重，加入等量生理鹽水，置于組織搗碎機(jī)中迅速勻漿3～5min，并用4層滅菌紗布過(guò)濾，濾渣反復(fù)勻漿，合并濾液。在濾液中加入甲醛，使其終含量為0.4%，充分搖勻，等量分裝于三個(gè)玻璃瓶中，標(biāo)記為1、2、3號(hào)。用玻塞蓋口再用溶蠟密封，置于37℃環(huán)境中作用24h，每3h振搖一次，使其充分滅活。1號(hào)、2號(hào)滅活苗中分別加入蜂膠和黃芪多糖為佐劑，3號(hào)不加作對(duì)照。

2.4.2 ?無(wú)菌檢驗(yàn) ?取制備的滅活苗分別接種于LB平板、血平板及厭氧肉湯，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察到?jīng)]有細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.4.3 ?安全試驗(yàn) ?選20只3日齡易感健康雛鴨，分為2組分別于背煩交界處皮下注射滅活苗2ml/只，并作空白對(duì)照，觀察9d，無(wú)異常情況。

2.5 ?高免卵黃抗體的制備

2.5.1 ?疫苗免疫 ?取160日齡試驗(yàn)蛋雞60只，分為三組，隔離飼養(yǎng)一周，無(wú)異常情況。第1次免疫滅活苗1ml/只，間隔10d進(jìn)行第2次免疫2ml/只，再間隔10d進(jìn)行第3次免疫2ml/只。

2.5.2 ?卵黃抗體效價(jià)的測(cè)定 ?采用雞胚中和試驗(yàn)法測(cè)定卵黃抗體的中和效價(jià)，每組分別吸取5×1 ml卵黃，并作倍比稀釋?zhuān)?8～212 5個(gè)稀釋度的卵黃抗體與等量200ELD50病毒液混合，經(jīng)37℃中和1h后，接種10日齡SPF雞胚，0.2ml/枚，各5枚，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。8d內(nèi)觀察雞胚死亡情況，按Reed-Muench法計(jì)算卵黃抗體中和效價(jià)。

2.6 ?高免卵黃抗體治療DVH效果 ?在山東蒙陰縣選擇森泉家禽合作社的小型蛋雞場(chǎng)，正常飼喂1周后無(wú)異常情況出現(xiàn)，使用黃芪組織滅活苗進(jìn)行免疫，免疫三次后收集產(chǎn)蛋，將卵黃用生理鹽水稀釋10倍，4℃靜置過(guò)夜。

通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀對(duì)發(fā)病鴨群進(jìn)行初步診斷，然后對(duì)死亡雛鴨進(jìn)行病理解剖，主要觀察肝臟的病變，對(duì)有典型病變的鴨群立即使用上步中制備的高免卵黃抗體進(jìn)行治療，方法是每只雛鴨頸部皮下注射1ml。觀察記錄卵黃抗體對(duì)該病的治愈率。

3 ?結(jié)果

3.1 ?電鏡觀察結(jié)果 ?見(jiàn)圖1。

3.2 ?ELD50測(cè)定結(jié)果 ?見(jiàn)表2。

根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算得ELD50為（0.2ml）l06.659稀釋的病毒液。

3.3 ?RT-PCR診斷結(jié)果 ?病死雛鴨的肝臟組織用所設(shè)計(jì)的I型鴨肝炎和禽流感特異性引物分別進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)條件優(yōu)化，成功擴(kuò)增出目的片段，與預(yù)期片段大小相符，鑒定為I型鴨肝炎和禽流感混合感染。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂搪凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.4 ?卵黃抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果 ?見(jiàn)表3。

據(jù)Reed-Muench法計(jì)算得蜂膠組卵黃抗體效價(jià)為29，黃芪組卵黃抗體效價(jià)為210.8，對(duì)照組卵黃抗體效價(jià)為27.82。黃芪組效價(jià)明顯高于其它二者。

3.4 ?高免卵黃抗體治療DVH效果 ?蒙陰縣森泉家禽養(yǎng)殖合作社一肉鴨場(chǎng)，1200羽發(fā)病，發(fā)病日齡為4日齡，發(fā)病后緊急注射高免卵黃抗體后，僅有13只發(fā)病雛鴨死亡，治愈率達(dá)98.9%。

苗家溝養(yǎng)鴨散戶550羽3日齡發(fā)病雛鴨，經(jīng)緊急注射后，治愈率達(dá)98.2%。

從臨床治療效果看，高免卵黃抗體對(duì)鴨病毒性肝炎的治療效果顯著。

4 ?討論

在臨床中，雛鴨病毒性肝炎與水禽流感混合感染的病例有很多。病毒性肝炎以肝臟腫大、表面有點(diǎn)狀或淤斑樣出血及腎臟腫大出血為特征;如發(fā)病鴨在出現(xiàn)鴨肝炎病癥同時(shí)伴有一定的神經(jīng)癥狀和病死鴨的心肌及胰腺壞死或出血點(diǎn)的特征性病變，即有可能伴有水禽流感的感染。治療時(shí)可用鴨肝炎卵黃抗體和禽流感卵黃抗體進(jìn)行緊急接種，同時(shí)使用金剛烷類(lèi)、恩諾沙星類(lèi)抗生素控制后期病毒、細(xì)菌的混合感染。黃芪多糖是中藥黃芪中主要的天然活性成分，具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能、增加白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量、提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細(xì)胞活性、誘生干擾素等作用。在組織滅活苗制備過(guò)程中加入黃芪多糖可更有效地增加免疫效果，從而獲得效價(jià)較高的卵黃抗體，即可應(yīng)用于臨床鴨肝炎發(fā)病緊急治療。

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