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    qRT-PCR快速檢測(cè)漢灘病毒抗體中和活性實(shí)驗(yàn)方法的建立

    2017-11-06 01:24:56張曉曉張堯馮偉程林峰王芳應(yīng)旗康馬瑞雪馬鐵軍劉梓諭劉蓉蓉張亮葉偉張芳琳徐志凱吳興安
    生物技術(shù)通訊 2017年4期
    關(guān)鍵詞:病毒感染微量單抗

    張曉曉,張堯,馮偉,程林峰,王芳,應(yīng)旗康,馬瑞雪,馬鐵軍,劉梓諭,劉蓉蓉,張亮,葉偉,張芳琳,徐志凱,吳興安

    第四軍醫(yī)大學(xué) a.微生物學(xué)教研室;b.學(xué)員旅;陜西 西安 710032

    qRT-PCR快速檢測(cè)漢灘病毒抗體中和活性實(shí)驗(yàn)方法的建立

    張曉曉a,張堯b,馮偉b,程林峰a,王芳a,應(yīng)旗康a,馬瑞雪a,馬鐵軍a,劉梓諭a,劉蓉蓉a,張亮a,葉偉a,張芳琳a,徐志凱a,吳興安a

    第四軍醫(yī)大學(xué) a.微生物學(xué)教研室;b.學(xué)員旅;陜西 西安 710032

    目的:建立一種基于qRT-PCR的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)改良法,快速、定量檢測(cè)漢灘病毒感染中的中和抗體活性。方法:將本室前期制備的抗?jié)h灘病毒高中和活性鼠源性單抗3G1、鼠/人嵌合單抗1D9和感染劑量為100 TCID50的病毒混合液于37℃孵育1h后感染Vero-E6細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中漢灘病毒76-118株S基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上以細(xì)胞總RNA為檢測(cè)樣品,建立qRT-PCR快速、定量檢測(cè)漢灘病毒感染中中和抗體活性的實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)果和結(jié)論:建立了一種基于qRT-PCR的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)改良法,可定量測(cè)定漢灘病毒感染中的中和抗體活性,該法具有快速、靈敏、特異和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

    漢灘病毒;qRT-PCR;中和抗體;微量中和實(shí)驗(yàn);腎綜合征出血熱

    漢灘病毒(Hantaan virus,HTNV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae),漢坦病毒屬(Hantavirus),是一種分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒?;蚪M分為L(zhǎng)、M、S三個(gè)片段,分別編碼病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(glycoprotein,GP,包括Gn和Gc)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,NP)[1]。在臨床上主要引起以發(fā)熱、出血、急性腎功能損害和免疫功能紊亂為突出表現(xiàn)的腎綜合征出血熱(hemorrhag?ic fever with renal syndrome,HFRS)[2]。我國(guó)是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國(guó)家,該病具有流行范圍廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率高等特點(diǎn)。由于HFRS的宿主廣泛,傳播途徑多,迄今臨床上尚缺乏特異有效的治療藥物,因此其防治任務(wù)十分艱巨。而特異性疫苗是目前預(yù)防HFRS的最主要措施之一[3],因此準(zhǔn)確、高效地測(cè)定其中和抗體效價(jià)成為評(píng)價(jià)疫苗有效性以及檢測(cè)人群對(duì)HTNV感染后免疫力的關(guān)鍵。目前常用于檢測(cè)病毒中和抗體的方法主要是微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn),是病毒中和抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。然而,由于宿主細(xì)胞感染HTNV后一般不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic ef?fect,CPE),結(jié)果判定比較困難;且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),一般為9~13d,這些都極大地限制了利用傳統(tǒng)的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)HTNV中和抗體的作用。因此,研究一種方便、快捷、高通量的測(cè)定中和抗體中和作用的方法顯得十分必要。

    我們根據(jù)HTNV 76-118株S基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法建立了一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定HTNV中和抗體中和作用的實(shí)驗(yàn)方法,從而為HFRS新型疫苗的研究和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    非洲綠猴腎細(xì)胞Vero-E6購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);無血清培養(yǎng)基DMEM購(gòu)于Hyclone公司;胎牛血清購(gòu)于上海生工生物工程公司;One-Step PrimeScript RT-PCR Kit購(gòu)自TaKaRa公司;總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

    HTNV 76-118株為本實(shí)驗(yàn)室保存;1A8為抗HTNV NP特異性高親和力鼠源性單抗;3G1為抗HTNV高中和活性鼠源性單抗;1D9是本室以3G1為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的抗HTNV鼠/人嵌合單抗,也具有高中和活性,均為本室制備保存。

    細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自Thomson公司;LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司;IX71倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司;MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Stratagenen公司。

    1.2 HTNV感染的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)

    將Vero-E6細(xì)胞接種于1塊96孔板,于37℃孵箱中培養(yǎng)24h,待細(xì)胞培養(yǎng)至單層后備用。用DMEM培養(yǎng)基將HTNV(TCID50=10-5.89)稀釋至100倍 TCID50,并分別稀釋單抗 3G1、1D9 至 10μg/mL,將稀釋后的病毒液分別與DMEM、單抗3G1、單抗1D9等體積混合后于37℃孵育1h,將孵育后的混合液替換E6單層細(xì)胞的培養(yǎng)液,96孔板每孔加入100μL混合液,每組8個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔。37℃孵育90min后更換正常的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。96孔板每隔3d換液一次。第10d將96孔板于37℃和-80℃交替凍融3次,取裂解上清,用包被有抗HTNV NP的單抗1A8的酶標(biāo)板夾心ELISA檢測(cè)。

    1.3 基于qRT-PCR的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)改良法

    將Vero-E6細(xì)胞接種于2塊24孔板,微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)方法同1.2。24孔板每孔加入500μL混合液,每組10個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔。37℃孵育90min后更換正常的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24h提取病毒感染組、單抗3G1混合組、單抗1D9混合組、正常細(xì)胞組各1孔細(xì)胞總RNA,共提取10d,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.1 熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)、合成 根據(jù)HTNV 76-118株(GenBank登錄號(hào)為M14626.1)的S基因序列,利用Oligo6.0軟件及NCBI Blast分析設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物。上游引物為HTNV-F(5'-GAGCCTGGAGACCATCTG-3'),下游引物為HTNV-R(5'-CGGGACGACAAAGGATGT-3'),引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

    1.3.2 驗(yàn)證PCR引物的有效性 以HTNV cDNA為模板,用HTNV-F/R特異性引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,確定引物的有效性。

    1.3.3 熒光定量PCR反應(yīng)條件的建立 將從24孔板收取的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增,反 應(yīng) 體 系 為 25μL[SYBR Premix ExTaq(2×)12.5μL,HTNV-F(10μmol/L)和 HTNV-R(10μmol/L)各1μL,模板2μL,用ddH2O補(bǔ)足]。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 10s,95℃變性 5s,60℃退火/延伸20s,每個(gè)循環(huán)退火延伸結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào),共40個(gè)循環(huán)。在PCR過程中由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95℃,然后降至72℃,開始以0.2℃/s遞增加熱至95℃,檢測(cè)熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立1個(gè)空白對(duì)照即不加模板,當(dāng)空白對(duì)照為陰性時(shí)實(shí)驗(yàn)有效。Ct值≤30為陽性,Ct值>30為陰性。

    2 結(jié)果

    2.1 微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)

    培養(yǎng)10d后,將微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)的96孔板于37℃和-80℃反復(fù)凍融3次,取裂解上清作為待檢樣品,用單抗1A8作為包被抗體,ELISA檢測(cè)抗體的中和活性。結(jié)果顯示HTNV 76-118分別和單抗3G1、單抗D9孵育后感染細(xì)胞,細(xì)胞中殘留的HTNV 76-118明顯減少,表明上述特異性單克隆抗體均能有效抑制HTNV在細(xì)胞中的感染和復(fù)制(圖1)。

    2.2 基于qRT-PCR的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)改良法

    2.2.1 引物有效性驗(yàn)證 以HTNV的cDNA為樣品,PCR擴(kuò)增HTNV S基因片段,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,可見在1300bp左右有一條明亮條帶,大小與預(yù)期相符(圖2)。

    2.2.2 改良法qRT-PCR結(jié)果 將每隔24h從24孔板中提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)病毒基因。結(jié)果顯示感染24h后,中和抗體組(單抗3G1、單抗1D9)與HTNV 76-118孵育組病毒量明顯低于病毒感染組,與經(jīng)典的細(xì)胞微量中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。感染4d后病毒感染組的病毒量顯著增長(zhǎng),而中和抗體組病毒增量不大,因此,可以選擇感染后第4d作為最佳檢測(cè)時(shí)間,與傳統(tǒng)的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法相比大大縮短了檢測(cè)周期。見圖3。

    3 討論

    目前研究中的HTNV新型疫苗種類較多,疫苗接種后產(chǎn)生中和抗體的能力是評(píng)價(jià)其保護(hù)效應(yīng)的重要指標(biāo)[5],而且流行病學(xué)調(diào)查也須檢測(cè)人群中中和抗體水平。國(guó)內(nèi)外已建立了多種中和抗體活性檢測(cè)方法,如過氧化物酶抗過氧化物酶(peroxidase-anti-peroxidase,PAP)法[6-7]、病毒空斑減少中和實(shí)驗(yàn)(plaque reduction neutralizaion test,PRNT)[8]、微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)等。上述方法前期病毒感染過程基本相同,而后期檢測(cè)各有特色。PAP法在感染3~5d后即可用冷甲醇或丙酮固定細(xì)胞,通透后依序加入對(duì)應(yīng)的抗體,用DAB顯色后通過染色細(xì)胞計(jì)數(shù)。該法所需時(shí)間較短,且有一定的定量作用,但操作繁瑣,主觀性強(qiáng)。PRNT法是一種敏感度較高,可定量的抗體中和活性檢測(cè)方法,它是將病毒與抗體的混合液加入預(yù)先培養(yǎng)的受體細(xì)胞中,用空斑計(jì)數(shù)測(cè)定其中和滴度。該方法耗時(shí)長(zhǎng),通量低,主觀性強(qiáng),而且在測(cè)定過程中對(duì)HTNV的活性和敏感性要求較高。由于HTNV增殖周期長(zhǎng),且缺乏明顯的CPE,微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)在最常用的中和活性檢測(cè)方法之一。此方法通常在病毒感染細(xì)胞9d后用雙抗體夾心ELISA法或熒光細(xì)胞中和法進(jìn)行檢測(cè),同樣有耗時(shí)長(zhǎng)、通量低等缺陷。因此,急需發(fā)展快速有效的方法來進(jìn)行HFRS流行病學(xué)調(diào)查和評(píng)價(jià)HFRS新型疫苗保護(hù)效應(yīng)。

    圖1 微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖2 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    圖3 qRT-PCR檢測(cè)微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    近幾年,利用qRT-PCR檢測(cè)中和抗體中和作用在病毒疫苗滴度檢測(cè)方面得到廣泛推廣,如麻疹病毒疫苗、輪狀病毒疫苗及痘病毒疫苗等[9-10]。目前,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法分為染料法和探針法,這2種方法都已被證實(shí)比常規(guī)RT-PCR更快速、靈敏[11]。SYBR GreenⅠ是一種雙鏈DNA結(jié)合染料,可以與任何雙鏈DNA結(jié)合,不必因?yàn)槟0宀煌貏e定制,因此設(shè)計(jì)的程序通用性好,且價(jià)格相對(duì)較低、敏感度高。探針法則是通過探針偶聯(lián)不同熒光基團(tuán)而同時(shí)進(jìn)行多重檢測(cè),但相對(duì)成本較高。本研究中,我們對(duì)漢灘病毒的全基因組序列進(jìn)行了分析,針對(duì)其保守的S基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物,建立了一種SYBR GreenⅠRealtime PCR方法,可快速測(cè)定漢灘病毒感染中中和抗體活性,在感染24h后病毒量甚微時(shí)即可定量檢測(cè)到病毒核酸。結(jié)果顯示病毒感染組的病毒載量(8.047×10-3)高于單抗 3G1(1.96×10-3)和 1D9組(3.01×10-3),之后48和72h的后續(xù)檢測(cè)結(jié)果皆延續(xù)了此趨勢(shì)。感染4d后病毒組的病毒量有顯著增長(zhǎng),而中和抗體組病毒量增量不大。對(duì)感染第5~7d的樣本進(jìn)行持續(xù)檢測(cè),病毒感染組病毒增長(zhǎng)速度變緩,與第4d的檢測(cè)結(jié)果相似。但第8d后病毒感染組的病毒載量呈下降趨勢(shì),其原因可能是細(xì)胞在24孔板內(nèi)生長(zhǎng)8d后密度過高,細(xì)胞狀態(tài)下降導(dǎo)致通過細(xì)胞提取的核酸質(zhì)量不高,影響了檢測(cè)結(jié)果。因此,可選擇感染后第4d作為最佳檢測(cè)時(shí)間。與傳統(tǒng)方法相比,本實(shí)驗(yàn)通過熒光標(biāo)記放大了病毒感染信號(hào),從而大大提高了檢測(cè)靈敏度,縮短了檢測(cè)時(shí)間。同時(shí),在結(jié)果判讀方面減少了人為誤差,更加確實(shí)可信。

    [1] 金光香,王世文.漢坦病毒基因分型研究進(jìn)展[J].中國(guó)地方病防治雜志,2003,18(3):158-1601.

    [2] Ying Qikang,Ma Tiejun,Cheng Linfeng,et al.Con?struction and immunological characterization of CD40L or GM-CSF incorporated Hantaan virus like particle[J].Oncocarget,2016,7(39):63488-63503.

    [3] Jiang D B,Sun Y J,Cheng L F,et al.Construction and evaluation of DNA vaccine encoding Hantavirus glycoprotein N-terminal fused with lysosome-associat?ed membrane protein[J].Vaccine,2015,33(29):3367-3376.

    [4] WHO.Manual for the laboratory diagnosis and virologi?cal surveillance of influenza[Z].2015.

    [5] Lee S,Nguyen M T.Recent advances of vaccine adju?vants for infectious diseases[J].Immune Network,2015,15(2):51-57.

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    [7] Ogino M,Yoshimatsu K,Ebihara H,et al.N-acetylga?lactosamine(GalNAc)-speci fi c lectins mediate enhance?ment of Hantaan virus infection[J].Arch Virol,1999,144:1765-1777.

    [8] Rainwater-Lovett K,Rodriguez-Barraquer I,Cummings D A,et al.Valiztion in dengue virus plaque reduc?tion neutralization testing:systematic review and pool ed analysis[J].BMC Infect Dis,2012,12:233.

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    Establishment of a qRT-PCR Method for Quick Detection of Neutralizing Antibody Activity of Hantaan Virus

    ZHANG Xiao-Xiaoa,ZHNAG Yaob,FENG Weib,CHENG Lin-Fenga,WANG Fanga,YING Qi-Kanga,MA Rui-Xuea,MA Tie-Juna,LIU Zi-Yua,LIU Rong-Ronga,ZHANG Lianga,YE Weia,ZHANG Fang-Lina,XU Zhi-Kaia,WU Xing-Ana*
    a.Department of Microbiology;b.Student Brigade;Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
    *Corresponding author,E-mail:wuxingan@fmmu.edu.cn

    Objective:To develop a fast and accurate evaluation system for neutralization antibodies against Han?taan virus.Methods:Vero-E6 cells were incubated at 37℃for 1 hour in the presence of Hantaan virus at 100 TCID50infectious dose and candidate antibody(mAb 3G1 or murine/human chimeric mAb 1D9).The total cellular RNAs from the incubation mix were extracted.The specific primers were designed according to the S gene se?quence of Hantavirus 76-118 in the GenBank database.The extracted total RNAs as template,qRT-PCR was per?formed to detect the effect of neutralization antibodies for Hantaan virus.Results& Conclusion:The method called qRT-PCR-based micro-cell-neutralization test was successfully established,which is capable to quantify the neutralizing antibodies rapidly and acurrately.

    Hantaan virus;qRT-PCR;neutralization antibody;micro-neutralization test;hemorrhagic fever with renal syndrome

    Q78;R392.1

    A

    1009-0002(2017)04-0524-04

    2017-01-12

    國(guó)家自然科學(xué)基金(31470890,31270978);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃(2013KTCL03-06);軍隊(duì)重點(diǎn)課題(BWS13G024)

    張曉曉(1985-),女,微生物學(xué)碩士,(E-mail)281166325@qq.com

    吳興安,(E-mail)wuxingan@fmmu.edu.cn

    10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.024

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