HPLC—ELSD法測(cè)定肉制品中山梨糖醇

甘凝嵐

摘 要：建立肉制品中山梨糖醇的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-evaporation light scattering detector，HPLC-ELSD）測(cè)定法。實(shí)驗(yàn)采用乙腈-水溶液（7∶3，V/V）作為流動(dòng)相直接超聲提取樣品，經(jīng)Agilent ZORBAX NH2（4.6 mm×250 mm，5 ?m）色譜柱分離，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；優(yōu)化ELSD檢測(cè)器參數(shù)為飄移管溫度90 ℃，氮?dú)饬魉?.0 L/min。結(jié)果表明：山梨糖醇含量在0.2～5.0 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性，方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在1.28%～2.02%之間，回收率在88.3%～99.0%之間。本方法具有樣品前處理簡(jiǎn)便、方法檢出限低、方法重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，適用于肉制品中山梨糖醇含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：山梨糖醇；肉制品；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法

Determination of Sorbitol in Meat Products by HPLC-ELSD

GAN Ninglan

（Jiangsu Product Quality Testing and Inspection Institute， Nanjing 210007， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detection （HPLC-ELSD） method was developed for the determination of sorbitol in meat products .The samples were ultrasonically extracted using acetonitrile water （7：3， V/V） as mobile phase and separated on ZORBAX NH2 Agilent column， then detected by evaporative light scattering detector （ELSD）. Optimized ELSD detector parameters such as drift tube temperature and nitrogen flow rate were set at 90 ℃ and 2.0 L/min， respectively. The results showed that sorbitol displayed good linearity relationship over the concentration range of 0.2 to 10 mg/mL. The method precision （relative standard deviation， RSD） ranged from 1.28% to 2.02%， and the recovery was between 88.3% and 99.0%.This method has the advantages of simple sample pretreatment， low detection limit and good reproducibility. So it is useful for the determination of sorbitol in meat products.

Key words： sorbitol； meat products； high performance liquid chromatography-evaporation light scattering detector （HPLC-ELSD）

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

山梨糖醇又名山梨醇、薔薇醇、清涼茶醇、六羥基醇[1]，主要是由葡萄糖催化加氫法和淀粉糖化直接加氫法生產(chǎn)，也可用蔗糖為原料進(jìn)行生產(chǎn)[2]。山梨糖醇在食品工業(yè)中功能性很多，主要包括高黏性（促使食品增濃與定型）、吸濕性（使食品有潤(rùn)滑性和柔軟性）、甜味或涼爽的味覺(jué)、多價(jià)螯合劑、結(jié)晶改性劑（延遲結(jié)晶）和膨黏性能等[3]。因此，山梨糖醇的添加可使食品在整個(gè)保質(zhì)期內(nèi)各種品質(zhì)都保持不變。山梨糖醇是一種半天然、營(yíng)養(yǎng)型甜味劑，其甜度只有蔗糖（食糖）的60%，其發(fā)熱量也比食糖降低了1/3，是一種非生齲性物質(zhì)，現(xiàn)已廣泛用于糖尿病人專(zhuān)用的無(wú)糖型食品[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在肉制品的加工過(guò)程中，山梨糖醇的添加能夠增強(qiáng)肉制品體系對(duì)外加水分和自身水分的保持，提高體系的持水力，可以作為一種優(yōu)異的持水劑使用。例如，在相同的加工時(shí)間內(nèi)山梨糖醇的添加能夠降低肉制品的水分活度，有利于產(chǎn)品的貯藏；添加山梨糖醇還可以顯著縮短產(chǎn)品的生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品的得率及水分含量；同時(shí)，山梨糖醇的添加也能改善產(chǎn)品的品質(zhì)，使其硬度降低，更易咀嚼[5]。近年來(lái)，部分肉制品生產(chǎn)商開(kāi)始在肉制品的加工過(guò)程中加入山梨糖醇，作為持水劑使用。

據(jù)報(bào)道，美國(guó)要求在相應(yīng)食品包裝上說(shuō)明，山梨糖醇最大日攝入量為50 g。歐洲要求當(dāng)糖醇使用比例超過(guò)10%時(shí)，則須在相應(yīng)食品包裝上說(shuō)明可能引起輕度腹瀉。我國(guó)現(xiàn)有的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定肉制品中不得添加山梨糖醇，而調(diào)味品中的山梨糖醇可以“按生產(chǎn)需要適量使用”，但沒(méi)有明確限制其添加量。肉制品中常使用調(diào)味料來(lái)改善口感，若肉制品中測(cè)得山梨糖醇則必須符合帶入原則，且不得對(duì)食用者造成損害。由于內(nèi)服過(guò)量的山梨糖醇，會(huì)導(dǎo)致食用者腹瀉和消化紊亂，因此需要建立檢測(cè)肉制品中山梨糖醇的分析方法，為肉制品行業(yè)的規(guī)范發(fā)展提供標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

目前，檢測(cè)山梨糖醇常用的方法有高效液相色譜法[6-11]、液質(zhì)聯(lián)用法[12-14]、氣相色譜法[15-18]、氣質(zhì)聯(lián)用法[19]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20]、離子交換色譜-脈沖安培法[21]等。示差折光檢測(cè)器對(duì)外部環(huán)境要求較高，實(shí)驗(yàn)室的溫度、濕度以及流動(dòng)相的流速都會(huì)對(duì)其有較大影響，因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求相對(duì)嚴(yán)格。用氣相色譜法檢測(cè)山梨糖醇前必須對(duì)山梨糖醇經(jīng)行衍生化處理，但是這種處理很容易改變山梨糖醇的性質(zhì)。離子色譜法用于山梨糖醇含量的檢測(cè)研究較多，其靈敏度較好，但是山梨糖醇在電極表面會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而影響方法的準(zhǔn)確性。運(yùn)用質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)山梨糖醇，雖然靈敏度高，但樣品前處理操作復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法，具有樣品處理簡(jiǎn)單、基線(xiàn)穩(wěn)定、檢出限低、針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本方法的建立旨在為肉制品中山梨糖醇含量的測(cè)定做出基礎(chǔ)性的探索工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香腸制品、火腿腸、豬肉脯、牛肉干、醬鹵肉等共10 批次市售樣品均購(gòu)于南京各大超市。

乙腈（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；去離子水 美國(guó)Millipore公司；山梨糖醇（99%） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；A25實(shí)驗(yàn)室高剪切分散乳化機(jī) 上海喬榮電子科技有限公司；XW-80A漩渦混合器 上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；KQ-300E型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲波儀器有限公司；Heraeus Multifuge XIR型離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；1260型高效液相色譜儀、380型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取5.00 g粉碎后的肉制品于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入20.0 mL流動(dòng)相，渦旋混合均勻，超聲提取30 min，以8 000 r/min離心3 min，取適量上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液待上機(jī)分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（7∶3，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫箱溫度：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；漂移管溫度：90 ℃；氮?dú)饬魉伲?.0 L/min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精確稱(chēng)取山梨糖醇標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確吸取不同體積山梨糖醇的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將其用水稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1、2、4、5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。進(jìn)行高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-evaporation light scattering detector，HPLC-ELSD）檢測(cè)，根據(jù)樣品的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

由于肉制品中的基質(zhì)較為復(fù)雜，其中蛋白質(zhì)和油脂含量較高，在前處理過(guò)程中要盡量去除這些雜質(zhì)，同時(shí)也要保證樣品中山梨糖醇的提取率。實(shí)驗(yàn)比較了3 種前處理方法：方法1為參照GB/T22222—2008《食品中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的測(cè)定 高效液相色譜法》，樣品要經(jīng)石油醚去脂，蒸發(fā)凈石油醚，加入去離子水超聲提取，再加入沉淀劑沉淀蛋白，濾紙過(guò)濾，濾液再經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過(guò)濾，待上機(jī)檢測(cè)；方法2參照SN/T 3142—2012《進(jìn)口食品中D-甘露糖醇、麥芽糖、木糖醇、D-山梨糖醇的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜法》，樣品用去離子水超聲提取后，將提取液用容量瓶定容，再取出部分提取液經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化洗脫，最后經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾，待上機(jī)檢測(cè)；方法3為樣品經(jīng)流動(dòng)相乙腈-水（7：3，V/V）超聲提取，離心后直接經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾，待上機(jī)檢測(cè)。

圖1 不同方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig. 1 Effect of pretreatments on sorbitol recovery

由圖1可知，方法1由于沉淀劑易干擾目標(biāo)物山梨糖醇的提取，使得其回收率較低；雖然方法2的回收率較方法1高，但步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)；而方法3的回收率較高，且操作簡(jiǎn)單，因此，選用方法3作為本實(shí)驗(yàn)的前處理方法。

2.1.2 檢測(cè)器的選擇

參照GB/T22222—2008《食品中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的測(cè)定 高效液相色譜法》運(yùn)用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)山梨糖醇，該方法儀器系統(tǒng)平衡時(shí)間較長(zhǎng)、檢測(cè)過(guò)程中基線(xiàn)易飄移、方法檢出限較高，實(shí)驗(yàn)對(duì)檢測(cè)環(huán)境和流速要求較高且方法重現(xiàn)性較差。采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)山梨糖醇，檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定性較好、儀器檢出限較低、方法重現(xiàn)性較好。因此本方法選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)肉制品中的山梨糖醇。

2.1.3 ELSD參數(shù)的優(yōu)化

ELSD檢測(cè)主要受到2 個(gè)重要參數(shù)的影響：漂移管溫度和載氣（N2）流速。比較漂移管溫度分別為80、85、90、95、100 ℃時(shí)，載氣（N2）流速分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3 L/min時(shí)對(duì)山梨糖醇響應(yīng)強(qiáng)度的影響。

圖2 不同漂移管溫度（a）和不同氮?dú)饬魉伲╞）條件下山梨糖醇的響應(yīng)強(qiáng)度

Fig. 2 Response intensity of sorbitol at different drift tube temperatures （a） and different nitrogen flow rates （b）

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，漂移管溫度越高，山梨糖醇的響應(yīng)越好，信噪比越大，當(dāng)漂移管溫度過(guò)高達(dá)到95 ℃以上時(shí)，山梨糖醇的響應(yīng)反而下降，信噪比減?。浑S著氮?dú)饬魉俚奶岣?，山梨糖醇的響?yīng)越好，信噪比也不斷增大，在流速達(dá)到2.0 L/min以后，山梨糖醇的響應(yīng)強(qiáng)度變化趨于平衡。因此，最終選擇最適用于山梨糖醇檢測(cè)的ELSD參數(shù)設(shè)置條件：漂移管溫度為90 ℃，載氣流速為2.0 L/min。

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 最低檢出限和定量限

以空白肉制品，經(jīng)1.3.1節(jié)處理后，儀器進(jìn)樣10 μL時(shí)，山梨糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液最低檢出限為8.0 μg/mL，最低定量限為25 μg/mL。

2.2.2 工作曲線(xiàn)和線(xiàn)性范圍

取配制好的山梨糖醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)檢測(cè)，以山梨糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積計(jì)算其對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以其質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到線(xiàn)性回歸方程：y=1.25x-7.31，相關(guān)系數(shù)為0.999 2，線(xiàn)性范圍為0.2～5.0 mg/mL。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

吸取山梨糖醇標(biāo)準(zhǔn)工作液0.2、1、5 mg/mL，各質(zhì)量濃度均進(jìn)樣6 次，以峰面積計(jì)算精密度。由表1可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）介于1.28%～2.02%之間，精密度良好。

2.2.4 回收率

1 mg/mL山梨糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白牛肉干樣品、牛肉干樣品1mg/mL山梨糖醇加標(biāo)色譜圖如圖3所示。取不含有山梨糖醇的空白牛肉干9份，按0.2、1、5 mg/g 3種加標(biāo)水平加標(biāo)，經(jīng)1.3.1節(jié)方法處理樣品后，按1.3.2節(jié)條件用儀器檢測(cè)，由表2可知，回收率在88.3%～99.0%之間，RSD%均小于5.0%，符合分析要求。

2.2.5 雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的干擾

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肉制品中常用添加劑如防腐劑、著色劑、抗氧化劑等，這些雜質(zhì)在運(yùn)用本方法的處理、分析條件時(shí)，都沒(méi)有對(duì)山梨糖醇的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3 未知肉制品中山梨糖醇含量的測(cè)定

利用本方法對(duì)南京各大超市銷(xiāo)售的10 批次肉制品（包括香腸制品、火腿腸、豬肉脯、牛肉干、醬鹵肉等）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)檢測(cè)，所檢樣品中有4 批次產(chǎn)品檢出山梨糖醇。

3 結(jié) 論

采用高效液相色譜法氨基柱分離、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)肉制品中的山梨糖醇。結(jié)果表明，本方法可以基本排除肉制品中常見(jiàn)添加劑的干擾，若檢出陽(yáng)性樣品，可根據(jù)檢出量的大小來(lái)判斷：含量不高則因添加調(diào)味料而帶入的可能性較大；含量過(guò)高則生產(chǎn)時(shí)人為添加的可能性較大。該方法利用70%乙腈-水提取樣品，不僅能沉淀蛋白質(zhì)而且脂肪提取物和溶出雜質(zhì)較少，有效縮短了前處理時(shí)間，提高了回收率，同時(shí)針對(duì)山梨糖醇優(yōu)化了ELSD參數(shù)，使得此方法具有前處理簡(jiǎn)便、檢出限低、重現(xiàn)性好、針對(duì)性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以準(zhǔn)確、高效地測(cè)定肉制品中的山梨糖醇的含量。

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