響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波輔助提取諾麗果多酚工藝研究

孟蘄翾等

熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?70228

摘 要 為提高諾麗果肉中的多酚提取量，對諾麗果粉進(jìn)行超聲波輔助提取并進(jìn)行抗氧化活性測試。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用中心組合設(shè)計(jì)，通過4因素5水平的響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取諾麗果多酚工藝。結(jié)果表明：最優(yōu)提取工藝條件為乙醇濃度53%、液料比為1‥32、提取時(shí)間為33 min、提取溫度為50 ℃。在此工藝條件下多酚提取量為6.19 mg/g，抗氧化能力為149.36 μmol/（L trolox當(dāng)量），還原能力為13.5 μmol/（g抗壞血酸當(dāng)量）。

關(guān)鍵詞 諾麗；多酚；超聲波輔助提取；響應(yīng)曲面法

中圖分類號 TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of

Polyphenol from NONI Using Response Surface Methodology

MENG Qixuan， WU Yougen*， CUI Mengyuan， YUAN Langxing， ZHANG Junfeng

College of Horticulture and Landscape， Hainan University/Key Laboratory of Protection， Development and Utilization

of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228，China

Abstract To increase the extraction rate of polyphenol from noni， ultrasonic-assisted ethanol was applied. The antioxidant activity of noni extract was analyzed based on free radical scavenging activity using DPPH assay. Based on the single factor experiments， the interactive effects of four crucial parameters， including ethanol concentration， ratio of solvent to material， extraction time and temperature， were studied by central composite design and were assessed by response surface methodology（RSM）. The optimal process parameters for total extraction of polyphenol from noni were as follows： ethanol concentration was 53%，ratio of solvent to material was 1 ∶ 32， extraction time was 33 min， extraction temperature was 50 ℃. The extraction rate of polyphenol from noni was 6.19 mg/g， antioxidant activities was 149.36 μmol/L trolox equivalent， reducing ability was 13.5 μmol/g ascorbic acid equivalent.

Key words NONI；Polyphenol；Ultrasonic assisted extraction；Response surface methodology

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.021

諾麗（Morinda citrifolia L.）又稱海巴戟，是茜草科巴戟天屬植物，一種常綠小喬木或灌木，原產(chǎn)南太平洋諸島，在中國海南、云南等地有分布。諾麗果實(shí)作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，被波利尼西亞人食用已有2 000多年歷史[1]。諾麗果實(shí)富含豐富的活性物質(zhì)，有蒽醌類、萜類、生物堿、β-谷甾醇、多酚等[2]，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓、降血糖、消炎等功效[3]。近期研究表明，不同的干燥方法、萃取溶劑和存儲條件對提取物的總酚含量和抗氧化活性有顯著影響[4-6]。盡管一些研究致力于諾麗多酚成分的提取，但少有涉及其提取工藝的優(yōu)化。近年來，人們對“新的提取技術(shù)、自動化提取過程、縮短提取次數(shù)、減少有機(jī)溶劑的消耗量”需求日益增加。超聲波輔助提取技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于紫菜[7]、雞血藤[8]、余甘子果[9]等植物的多酚提取中。該技術(shù)簡單快速、提取效率高、能耗低，并減少溶劑的消耗[10-11]。本試驗(yàn)通過4組單因素試驗(yàn)探討了乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間和提取溫度對諾麗果中多酚提取效果的影響，并運(yùn)用Central Composite Design（CCD）設(shè)計(jì)，采用4因素5水平的響應(yīng)曲面分析法，優(yōu)化超聲波輔助提取諾麗果多酚工藝，為進(jìn)一步研究諾麗果多酚的生物活性及結(jié)構(gòu)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試原料及處理 2014年6月中旬于海南儋州熱科院試驗(yàn)農(nóng)場采集生長健康，外皮呈青白色的諾麗果實(shí)，超純水清洗后切片、曬干、粉碎后于干燥避光環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑及溶液 Folin-Ciocalteu試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%）、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）、Trolox（水溶性維生素E）、鹽酸、乙醇、Na2CO3等均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，試驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.3 儀器與設(shè)備 XB120A電子天平（Precisa公司）、KQ-300VDE 型三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Certeifuge 5424R離心機(jī)（Eppendorf公司）、S53紫外分光光度計(jì)（上海棱光儀器廠）、JFSD-100粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 諾麗果粉→過80目篩→稱重→超聲波提取→抽濾→離心（5 000 r/min）10 min→取清液濃縮→定容→測定吸光度（760 nm）→計(jì)算含量。

1.2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 多酚的測定以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu比色法，參照蔡文國[12]的方法略有改動。稱取0.050 g沒食子酸，用蒸餾水定容至100 mL，即得到500 μg/mL的沒食子酸溶液，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL上述溶液加入到50 mL容量瓶中，加入10 mL水，搖勻。分別加入1.5 mL Folin-Cioealteu試劑，2.0 mL 20% Na2CO3，用蒸餾水定容，置于50 ℃恒溫水浴鍋中顯色30 min，顯色后于760 nm波長處測定吸光度。

1.2.3 多酚含量的測定 按1.2.1工藝流程提取諾麗果多酚，將提取后的多酚提取液適當(dāng)稀釋后，按照1.2.2進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算諾麗果多酚含量。

1.2.4 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照Li[13]等研究的方法，于517 nm波長測定吸光度。

1.2.5 抗氧化能力的測定 以DPPH清除自由基活性為依據(jù)測定諾麗提取物抗氧化活性[14]。將稀釋后的多酚提取液，按1.2.4測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算諾麗果多酚的抗氧化活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將諾麗果提取物的抗氧化能力值表示為μmol/（L TE當(dāng)量）。

1.2.6 還原能力的測定 參照陳師瑩等[6]研究方法，以抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)品，于700 nm波長處測定吸光值，提取物還原力以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，表示為μmol/（g抗壞血酸當(dāng)量）。

1.2.7 單因素試驗(yàn) 選取乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素，以諾麗果多酚提取量作為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。固定其它條件，分別探討乙醇濃度（25%～85%）、液料比（1‥10～1‥50）、提取時(shí)間（10～50 min）、提取溫度（30～70 ℃）對諾麗果多酚提取量的影響，各因素試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，各因素水平見表1。

1.2.8 響應(yīng)面法優(yōu)化 超聲波輔助提取諾麗果中的多酚，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素，采用中心組合試驗(yàn)CCD設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行4因素5水平試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝，重復(fù)3次，取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，因素水平見表2。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 20分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design Expert 8.0.6建立響應(yīng)曲面模型，并對超聲波輔助提取試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸濃度y（mg/mL）與吸光度x的標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=8.109 8x-0.079 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0，說明該檢測方法下沒食子酸溶液濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

trolox濃度C（μmol/L）與吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)方程：C=-146.82A+186.84，R2=0.999 1，表明該線性關(guān)系良好。

抗壞血酸酸濃度y（μmol/g）與吸光度x的標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=22.372x-1.692 5，R2=0.999 1。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度 由表1可知，隨著乙醇濃度的升高，多酚提取量呈上升趨勢，當(dāng)乙醇濃度為55%時(shí)，多酚提取量達(dá)最大值，隨后逐漸下降。因此，乙醇濃度以55%為最佳。

2.2.2 液料比 由表1可知多酚提取量隨液料比的增加而增大，當(dāng)液料比達(dá)到1‥30和1‥50時(shí)，多酚提取量達(dá)最大。因此，結(jié)合溶劑用量及濃縮工藝考慮，最佳液料比為1‥30。

2.2.3 提取時(shí)間 由表1可知，隨著提取時(shí)間的延長，諾麗果中多酚含量呈“先增后降”趨勢，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，溶出的可溶性成分最多，多酚含量達(dá)到最大值。隨著提取液黏度增大，損耗有所增強(qiáng)，故呈現(xiàn)出降低趨勢。因此，提取時(shí)間以30 min為佳。

2.2.4 提取溫度 由表1可知，提取溫度為50 ℃時(shí)，諾麗果中多酚提取量最大值為5.35 mg/g。多酚提取量隨著提取溫度的升高而逐漸增加，達(dá)到最大值后，繼而下降，但整個(gè)過程變化幅度較小。溫度升高使得多酚氧化，提取量下降。因此，提取溫度為50 ℃較適宜。

2.3 響應(yīng)曲面分析法結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果及分析 運(yùn)用CCD設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，以諾麗果多酚提取量為響應(yīng)值，通過4因素5水平的響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波輔助提取諾麗果多酚的工藝，結(jié)果見表3?；貧w模型擬合將所得數(shù)據(jù)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以多酚含量（Y）為響應(yīng)值與乙醇濃度（X1）、液料比（X2）、提取時(shí)間（X3）及提取溫度（X4）4因素間的回歸方程為：Y=6.27-0.22X1+0.15X2+0.17X3-0.06X4+0.21X1X2+0.29X1X3+0.34X1X4 +0.13X2X3+0.13X2X4-0.13X3X4-1.73X12-0.48X22-0.35X32-0.19X42。由回歸方程分析可知（表4），以多酚含量建立的回歸整體模型為極顯著（p<0.01）。同時(shí)模型的決定系數(shù)R2=0.909 3，F(xiàn)=10.03，變異系數(shù)為6.32%（<10%），失擬項(xiàng)=0.347 4（p>0.05），不顯著，模型的Adeq Precision=10.212，該值是模型信噪比的反映。Adeq Precision>4即表明模型的響應(yīng)信號足夠強(qiáng)，可以用來擬合試驗(yàn)結(jié)果。綜合表明該模型是合適的，可以用來分析和預(yù)測諾麗果中多酚的提取量。該模型中的一次項(xiàng)X2、X3顯著（p<0.05），二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42極顯著（p<0.01），這表明此4個(gè)因素對諾麗果多酚提取量均有一定影響。經(jīng)響應(yīng)曲面法分析，最佳提取條件為乙醇濃度（X1）=53.37%、液料比（X2）=1‥31.54、提取時(shí)間（X3）=32.88 min、提取溫度（X4）=47.50 ℃，此時(shí)諾麗果多酚提取量為6.32 mg/g。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 在其它因素不變的情況下，分析各因素間的兩兩交互作用對多酚提取量的影響，利用Design Expert 8.0.6軟件擬合繪制模型。由圖1～3可知，多酚提取量隨乙醇濃度的增大快速升高，達(dá)到峰值后又迅速降低，當(dāng)乙醇濃度為45%～55%，多酚提取量達(dá)到最大值。圖4中等高線近似圓形，表明提取時(shí)間和液料比的交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。當(dāng)乙醇濃度和提取溫度一定時(shí)，多酚提取量隨提取時(shí)間的延長或液料比增加呈先增后減趨勢，當(dāng)提取時(shí)間為30～35 min，液料比為1‥30～1‥35時(shí)，多酚提取量最大。當(dāng)乙醇濃度和提取時(shí)間一定時(shí)，多酚提取量隨提取溫度的增加或液料比增加呈先升后降趨勢（圖5）。固定乙醇濃度和液料比，多酚提取量隨提取溫度的增加或提取時(shí)間的延長呈拋物線型緩慢變化（圖6）。交互作用的響應(yīng)曲面變化平緩，等高線為近圓形，表明提取溫度、提取時(shí)間、液料比3因素對多酚提取量影響較小，因素間的交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致（圖5～6）。

2.3.3 最優(yōu)條件驗(yàn)證 為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?，根?jù)響應(yīng)曲面試驗(yàn)所得的優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)根據(jù)實(shí)際操作的局限性，修正后的最佳提取條件為乙醇濃度53%、液料比1‥32、提取時(shí)間33 min、提取溫度50℃，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，多酚平均提取量為6.19 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.26%，與理論預(yù)測值（6.32 mg/g）的相對誤差為-2.06%，預(yù)測值與實(shí)測值接近，說明該模型所得的優(yōu)化條件參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的，采用響應(yīng)面法得到的諾麗果多酚提取工藝參數(shù)可靠、重現(xiàn)性好，具有實(shí)用價(jià)值。

2.4 抗氧化能力及還原力測定結(jié)果

對驗(yàn)證試驗(yàn)所提取的諾麗果多酚進(jìn)行抗氧化活性及還原力測定結(jié)果表明，采用該響應(yīng)曲面模型所提取的諾麗果多酚的抗氧化能力為149.36 μmol/（L TE 當(dāng)量），還原力為13.5 μmol/（g抗壞血酸當(dāng)量）。由此可見，該工藝條件下提取的諾麗果中多酚具有較高的抗氧化能力及一定的還原能力。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用單因素和響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)對超聲波輔助提取諾麗果多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并建立回歸模型。通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面和等高線圖分析探討各因素對提取量的作用。史運(yùn)杰等[15]采用響應(yīng)面法優(yōu)化花紅葉多酚提取工藝結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度過高多酚提取率下降，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這一變化的原因是由于有機(jī)溶劑濃度過高使細(xì)胞膜變性，降低細(xì)胞膜的通透性，阻礙了多酚類物質(zhì)的溶出[16]。另一方面，當(dāng)溫度高于50 ℃，多酚提取量開始下降，這可能是由于高溫促使多酚降解造成的[17]。但Karacabey等[18]認(rèn)為過高的溫度會導(dǎo)致植物組織的軟化，破壞酚類化合物與蛋白質(zhì)、多糖之間的相互作用，使酚類化合物的溶解度上升，提高擴(kuò)散速率，從而提取量升高。因此，筆者認(rèn)為這2種原因使溫度對提取量的影響作用相互阻抑，多酚提取量隨溫度的變化呈較平緩趨勢。

響應(yīng)曲面法不僅克服了單因素忽視因素間互作關(guān)系的缺點(diǎn)，并且能夠彌補(bǔ)其它一些試驗(yàn)不能在給出的整個(gè)區(qū)內(nèi)找到因素和響應(yīng)值之間明確回歸方程的缺點(diǎn)[19]。經(jīng)回歸模型預(yù)測及驗(yàn)證，超聲波輔助提取諾麗果多酚的最佳工藝條件為：乙醇濃度53%、液料比1‥32、提取時(shí)間33 min、提取溫度50 ℃，其多酚提取量為6.19 mg/g。采用該方法提取的諾麗果多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力，抗氧化能力為149.36 μmol/（L TE當(dāng)量），還原能力為13.5 μmol/（g抗壞血酸當(dāng)量）。該提取工藝操作方便，減少提取時(shí)間，降低耗能，節(jié)約成本，提取產(chǎn)品抗氧化能力良好，是較為理想的提取多酚的方法，可以在諾麗酚類物質(zhì)提取工藝篩選研究中進(jìn)一步推廣。

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