鉤枝藤生物堿對斜紋夜蛾幼蟲的毒殺活性

王軍等

摘 要 探討鉤枝藤總生物堿及3個(gè)單體化合物[（1）Ancistrocline，（2）5′-O-demethylhamatintine，（3）N-methylphylline]對斜紋夜蛾幼蟲的毒殺活性，旨在開發(fā)新型植物源農(nóng)藥。采用浸蟲法測定鉤枝藤總堿對斜紋夜蛾3齡幼蟲的毒殺活性和采用飼料混毒法測定鉤枝藤單體化合物對斜紋夜蛾初孵幼蟲毒殺活性。結(jié)果表明：鉤枝藤總堿對斜紋夜蛾3齡幼蟲具有較強(qiáng)的毒殺作用，其第3天和第5天的LC50值分別為2.61 mg/mL和0.91 mg/mL。單體化合物對斜紋夜蛾初孵幼蟲具有明顯的抑制生長發(fā)育作用，其中以化合物（2）抑制作用最強(qiáng)，主要表現(xiàn)為化蛹率（23.33%）、羽化率（13.33%）顯著低于對照（化蛹率90.00%、羽化率86.67%）。

關(guān)鍵詞 鉤枝藤；生物堿；斜紋夜蛾；毒殺活性；抑制生長發(fā)育

中圖分類號(hào) S481.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Insecticidal Activity of the Alkaloids from Ancistrocladus

tectorius Against the Larvae of Spodoptera litura

WANG Jun1， YAN Chao2， CAI Caihong1， FENG Gang2， ZHANG Jing2 *， DAI Haofu1 *

1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory

of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Hainan Key Laboratory for Research

and Development of Natural Products from Li Folk Medicine， Haikou， Hainan 571101， China

2 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract The insecticidal activity of the total alkaloids and its 3 compounds[（1）： Ancistrocline，（2）： 5′-O-demethylhamatintine，（3）： N-methylphylline]of Ancistrocladus tectorius against the larvae of Spodoptera litura were discussed for the development of new type of botanical pesticides. The toxicity of the total alkaloids to the 3rd instar larvae of S. litura was determined by insect-dip method. The toxicity of 3 compounds to the larvae of S. litura was tested by diet-incorporation. The results indicated that the total alkaloids of A. tectorius had strong toxic effect on the 3rd instar larvae and the LC50 values of 3 d and 5 d was 2.61 mg/mL and 0.91 mg/mL respectively. The growth of newly hatched instar larvae of S. litura was also inhibited by the three compounds. The compound（2）had the strongest inhibition effects with pupation rate 23.33% and eclosion rate 13.33%， which was significantly lower than those of control（pupation rate 90.00%， eclosion rate 86.67%）.

Key words Ancistrocladus tectorius； Alkaloids； Spodoptera litura； Insecticidal activity； Growth and development inhibition

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.017

斜紋夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）屬鱗翅目（Lepidoptera）、夜蛾科（Noctuidae），是世界重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一。以幼蟲取食寄主植物的果實(shí)、花、葉等，寄主植物多達(dá)99科290多種[1]。在我國淮河以北間歇性發(fā)生為害，淮河以南常年發(fā)生為害。在大田栽培作物中主要為害棉花、大豆、煙草、甘薯、花生等[2]；而在蔬菜中則以十字花科蔬菜和水生蔬菜受害最為嚴(yán)重。近年來，斜紋夜蛾在各地大發(fā)生的頻率明顯提高，且呈上升趨勢[3-5]。由于化學(xué)藥劑的施用造成環(huán)境污染和害蟲耐藥性的問題，新型天然、高效、安全的物質(zhì)被用來開發(fā)殺蟲劑已成為一種必然趨勢。

運(yùn)用植物生物堿對斜紋夜蛾的研究較少，如煙堿能抑制斜紋夜蛾3齡幼蟲CarE的活性，并誘導(dǎo)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性[6]；雷公藤堿對斜紋夜蛾有強(qiáng)烈的忌避、拒食作用[7]；白前生物堿對斜紋夜蛾3齡和5齡幼蟲具有較好的拒食活性[8]，因而，植物生物堿具有廣闊的開發(fā)利用前景，值得深入研究。

鉤枝藤[Ancistrocladus tectorius（Lour.）Merr.]為鉤枝藤科（Ancistrocladaceae）鉤枝藤屬（Ancistrocladus Wall.）植物，該科全世界僅1屬，約20種。我國有1種，生于山坡、山谷密林中或山地?zé)釒в炅种?，海?00～700 m，見于海南各地[9-10]和廣西大青山[11-13]，分布于柬埔寨、印度、印度尼西亞、老撾、馬來西亞、緬甸、新加坡、泰國、越南等國家[2]。鉤枝藤作為一種民間常用藥物[14-16]，具有抗寄生蟲感染、消炎止瀉、行氣散結(jié)之功效，可用于治療瘧疾、痢疾、胃痛、跌打損傷、蛇毒等[15，17]。鉤枝藤的化學(xué)成分主要為生物堿類[18-28]，其生物活性主要有抗瘧原蟲[29]、抗寄生蟲[30]、抗菌[14，30-32]、抗病毒[30]、抗腫瘤[29-30]、抗HIV[27]等方面，但對于在斜紋夜蛾上的應(yīng)用研究未見報(bào)道。本研究在室內(nèi)測定了鉤枝藤總生物堿及其單體化合物對斜紋夜蛾幼蟲的毒殺活性和抑制生長發(fā)育作用，將為充分利用鉤枝藤植物資源開發(fā)新型植物源殺蟲劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鉤枝藤枝條于2011年5月采自海南省昌江縣，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所代正福副研究員鑒定，憑證標(biāo)本（No. TX20110512）存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。斜紋夜蛾卵用采自海南省海口市美蘭區(qū)桂林洋福云村未施藥的蓮藕葉，在室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖多代，試驗(yàn)時(shí)挑選大小一致、健康活潑的初孵幼蟲和3齡中期幼蟲供試。

1.2 方法

1.2.1 鉤枝藤總堿提取及單體化合物分離方法

鉤枝藤枝條（68.00 kg）曬干后加工成粉末，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇浸提3次，每次7 d。所得濾液經(jīng)真空減壓濃縮至無乙醇味，得到乙醇提取物。將乙醇提取物用2%的鹽酸溶液反復(fù)溶解，過濾得酸水液，酸水液用氯仿萃取3次，減壓濃縮回收溶劑后得到酸水氯仿萃取物總堿A（179.00 g）。萃取后所剩的酸水相加入25%氨水至pH值為10.0，之后再用氯仿萃取3次，減壓濃縮回收溶劑后得到堿水氯仿萃取物總堿B（17.20 g）。

總堿A的分離純化：將酸水氯仿萃取物總堿A經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇（1 ∶ 0～0 ∶ 1）梯度洗脫得到9個(gè)部分（Fr.1～Fr.9）。其中Fr.1（77.00 g）再經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（1 ∶ 0～0 ∶ 1）梯度洗脫得到7個(gè)部分（Fr.1.1～Fr.1.7），F(xiàn)r.1.6（6.60 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮（12 ∶ 1～1 ∶ 1）梯度洗脫得到6個(gè)亞組分（Fr.1.6.1～Fr.l.6.6），其中Fr.l.6.6（2.90 g）經(jīng)反相柱色譜甲醇-水（1 ∶ 9～1 ∶ 0）、硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯（10 ∶ 1～1 ∶ 1）洗脫，并且經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物（1）（120.20 mg）。Fr.6（2.50 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（純甲醇）得到5個(gè)部分（Fr.6.1～Fr.6.5），其中Fr.6.1（1.10 g）經(jīng)反相柱色譜、硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇（10 ∶ 1）洗脫得到化合物（2）（6.30 mg）。

總堿B（17.00 g）經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇（1 ∶ 0～0 ∶ 1）梯度洗脫得到8個(gè)組分（Fr.1～Fr.8）。Fr.5（2.50 g）經(jīng)反相柱色譜和重結(jié)晶得到化合物（3）（70.00 mg）。

1.2.2 化合物鑒定 Ancistrocline（1）無色結(jié)晶（氯仿），mp 229～233 ℃，[α]2D2+61.7（c2.1，氯仿），遇10%的硫酸顯墨綠色，改良碘化鉍鉀噴霧顯橘紅色，初步推測該化合物可能為生物堿。EI-MS m/z： 421[M]+，結(jié)合1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)推定其分子式為C26H31NO4。1H NMR（CDCl3， 500 MHz）δ 0.94（3H， d， J=6.3 Hz， CH3-3）， 1.42（3H， d， J=6.2 Hz， CH3-1）， 1.86（1H， m， H-4a）， 2.09（1H， m， H-4b）， 2.12（3H， s， CH3-2'）， 2.29（1H， m， H-3）， 2.43（3H， s， CH3-N）， 3.72（1H， m， H-1）， 3.85（3H， s， OCH3-8）， 3.93（3H， s， OCH3-4'）， 3.98（3H， s， OCHs-5'）， 6.50 （1H， s， H-7）， 6.75（1H， d， J=7.9 Hz， H-6'）， 6.80 （1H， s， H-3'）， 6.83（1H， d， J=7.9 Hz， H-8'）， 7.18（1H， t， J=7.9 Hz， H-7'）。13C NMR（CDCl3， 125 MHz）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[33]報(bào)道基本一致，故鑒定為ancistrocline。

5'-O-Demethylhamatintine（2）黃色油狀，遇10%的硫酸顯藍(lán)黑色，改良碘化鉍鉀噴霧顯橘紅色，初步推測該化合物可能為生物堿。EI-MS m/z： 391 [M]+，結(jié)合1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)推定其分子式為C24H25NO4。1H NMR（DMSO-d6， 500 MHz）： δ 1.16（3H， d， J=6.5 Hz， CH3-3）， 1.99（3H， s， CH3-2'）， 2.39（1H， dd， J=17.0， 10.2 Hz， H-4a）， 2.58（1H， dd， J=17.0， 5.2 Hz， H-4b）， 3.07（3H， s， CH3-1）， 3.50 （1H， m， H-3）， 3.72（3H， s， OCH3-8）， 3.74（3H， s， OCH3-4'）， 6.65（1H， d， J=7.5 Hz， H-8'）， 6.70（1H， s， H-7）， 6.89（1H， d， J=7.5 Hz， H-6'）， 6.91（1H， s， H-3'）， 7.05（1H， t， J=7.5 Hz， H-7'）， 8.20（2H， s， OH-6，4'）。13C NMR（DMSO-d6， 125 MHz）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[34]報(bào)道基本一致，故鑒定為5 '-O-Demethylhamatintine。

N-methylphylline（3）無色結(jié)晶（氯仿），mp 265～267℃，[α]2D2（c 0.01，甲醇），遇10%的硫酸顯淺綠色，改良碘化鉍鉀噴霧顯橘紅色，初步推測該化合物可能為生物堿。EI-MS m/z： 191[M]+，結(jié)合1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)推定其分子式為C12H7NO。1H NMR（DMSO-d6， 500 MHz）： δ 1.03（3H， d， J=6.3 Hz， CH3-3）， 1.19（3H， d， J=6.3 Hz， CH3-1）， 2.23（1H， m， H-3）， 2.24（3H， s， CH3-N）， 2.42（2H， d， J=8.0 Hz， H-4）， 3.49（1H， m， H-1）， 6.42（1H， d， J=7.4 Hz， H-5）， 6.52（1H， d， J=7.4 Hz， H-7）， 6.81（1H， t， J=7.4 Hz， H-6）， 9.26（1H， s， OH）。13C NMR（DMSO-d6， 125 MHz）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[35]，故鑒定為N-methylphylline。

1.2.3 對斜紋夜蛾3齡幼蟲的毒殺作用 采用浸蟲法[36]，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)10頭試蟲。分別統(tǒng)計(jì)處理后第3天和5天的死亡情況，計(jì)算死亡率。用毛筆輕觸蟲體，不動(dòng)或不能正常爬動(dòng)者計(jì)為死亡。

1.2.4 對斜紋夜蛾初孵幼蟲的殺蟲活性 采用飼料混毒法[37]測定鉤枝藤單體生物堿類化合物（1）～（3）的殺蟲活性。先將純品化合物用丙酮配制成1 mg/mL，個(gè)別不溶的樣品加少量DMSO（含量在1%以下），配制斜紋夜蛾半人工飼料，趁熱在12孔培養(yǎng)板的每孔加入1 mL半人工飼料。待飼料凝固后，每孔加待測樣品20 μL，每個(gè)樣品加入10孔，重復(fù)3次。待溶劑揮發(fā)后，每孔接入1頭孵化后2 h的斜紋夜蛾初孵幼蟲，放入溫度為（25±1）℃、濕度80%的養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)。7 d后換喂正常飼料，直至成蟲羽化，以丙酮（丙酮+助溶劑）為溶劑對照，印楝素作為藥劑對照，分別于接蟲后7、10、14和20 d檢查試蟲死亡情況，統(tǒng)計(jì)試蟲幼蟲期、蛹期及化蛹情況，稱量蛹重，統(tǒng)計(jì)羽化蟲數(shù)量，并計(jì)算死亡率、化蛹率和羽化率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將死亡率轉(zhuǎn)化為幾率值，濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)后進(jìn)行線性回歸，回歸方程使用機(jī)值分析法計(jì)算。采用單因素方差分析DMRT法多重比較，p<0.05為具有差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對斜紋夜蛾3齡幼蟲的毒殺作用

結(jié)果顯示，鉤枝藤總堿在處理濃度分別為10、5、1、0.5和0.1 mg/mL時(shí)，對斜紋夜蛾3齡幼蟲具有不同程度的毒殺作用（見表1）。其中以10 mg/mL處理組的殺蟲活性最高，其3 d和5 d的校正死亡率分別為70.00%和83.33%；10、5、1 mg/mL 處理組隨著時(shí)間的延長，5 d較3 d的校正死亡率增長幅度相同，均為13.33%；0.5 mg/mL處理組雖然在處理后第3天的毒殺活性較差（26.67%），但隨著處理時(shí)間的延長殺蟲活性明顯增強(qiáng)，其5 d的校正死亡率為36.67%，優(yōu)于對照；而低濃度（0.1 mg/mL）處理組隨著時(shí)間的推移，校正死亡率增幅不大，其5 d 較3 d的校正死亡率僅為3.33%。以機(jī)率值分析法分別對上述結(jié)果進(jìn)行擬合，得其處理后3 d和5 d的LC50值分別為2.61 mg/mL和0.91 mg/mL，卡方檢驗(yàn)證實(shí)其卡方值均小于7.81，說明試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。

2.2 對斜紋夜蛾初孵幼蟲的殺蟲活性

由表2可知，鉤枝藤生物堿單體化合物（1）～（3）對斜紋夜蛾初孵幼蟲均具有一定的毒殺活性，其中化合物（2）和化合物（3）的毒殺作用較高，第20天的校正死亡率分別為35.93%和37.00%，雖然高于化合物（1），但其活性強(qiáng)度間無顯著性差異，說明上述化合物（1）～（3）對斜紋夜蛾幼蟲的毒殺活性強(qiáng)度效果相當(dāng)。

在試蟲發(fā)育期，對照組約21 d即可正?；?，而經(jīng)鉤枝藤單體化合物（1）～（3）處理后的試蟲，對幼蟲期的影響不大。對斜紋夜蛾幼蟲的蛹期有較大影響，其中化合物（1）的蛹期最長，約為14 d，而對照組蛹期只需約10 d。處理組存活幼蟲均能正?；己陀鸹?，其化蛹率和羽化率均明顯低于對照組，其中化合物（2）的幼蟲期所需的時(shí)間最長為22.74 d，而對照所需時(shí)間為21.53 d；化蛹率（23.33%）、羽化率（13.33%）最低，顯著低于對照，對照對應(yīng)的化蛹率、羽化率分別為：90.00%和86.67%（見表3）。

3 討論與結(jié)論

植物生物堿是植物在與昆蟲協(xié)同進(jìn)化過程中形成的一大類具有防御功能的次生代謝物質(zhì)，種類繁多，并且對昆蟲具有毒殺、拒食、忌避、抑制生長發(fā)育、不育、抗蟲、引誘等多種生物活性[38]。具有殺蟲活性的生物堿在環(huán)境中容易降解，作用方式獨(dú)特，對天敵和有益生物安全，不易產(chǎn)生抗藥性，符合人們對理想殺蟲劑的要求[39]。自第一個(gè)煙堿類殺蟲劑吡蟲啉問世以來，已有苦參堿、百部堿、藜蘆堿、雷公藤堿、小檗堿等幾十種被開發(fā)利用[40-42]，且多數(shù)現(xiàn)已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)。因而，對生物堿類化合物的市場開發(fā)前景廣闊，結(jié)合本研究，有望從鉤枝藤生物堿中開發(fā)出新型植物源殺蟲劑。

本研究發(fā)現(xiàn)鉤枝藤總生物堿以及3個(gè)單體生物堿類化合物（1）～（3）對斜紋夜蛾幼蟲具有一定的殺蟲活性，化合物（1）～（3）均為異喹啉類生物堿，其中（1）為萘基四氫異喹啉類生物堿，其為鉤枝藤的主要成分；（2）為萘基二氫異喹啉類生物堿；（3）為無萘基取代的異喹啉類生物堿。從已報(bào)道的異喹啉類生物堿來看，其主要的生物活性表現(xiàn)在抗菌、抗氧化、抗瘧、抗腫瘤、抗HIV方面。異喹啉類生物堿的生物活性與其結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，如N原子的烷基化會(huì)使抗菌活性增加；具有萘基異喹啉骨架結(jié)構(gòu)的化合物具有較好的抗瘧效果；芳香環(huán)上的羥基數(shù)目增加以及N的季銨化可明顯增加抗腫瘤活性等[43]。然而，對于異喹啉類生物堿的殺蟲或抗蟲活性則鮮有報(bào)道，Bringmann等[44]將從與鉤枝藤同屬的植物A. congolensis葉中提取到的生物堿Dioncophylline A添加到草地夜蛾（Spodoptera littoralis）幼蟲的人工飼料中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 d后幼蟲的死亡率明顯增高。其結(jié)構(gòu)中OH官能團(tuán)的變形可能是導(dǎo)致活性明顯增強(qiáng)的原因。結(jié)合本研究，鉤枝藤總堿對斜紋夜蛾幼蟲有較強(qiáng)的毒殺活性，隨著濃度的升高和時(shí)間的延長，幼蟲的死亡率也隨之增加，其中第3天和第5天的LC50值分別為2.61 mg/mL和0.91 mg/mL。但3個(gè)單體化合物對害蟲主要表現(xiàn)為抑制生長發(fā)育作用，雖然在處理前期對害蟲影響不大，但在處理后20 d也表現(xiàn)出較高的活性，明顯影響害蟲化蛹，大部分幼蟲在蛹期死亡，處理組化蛹率和羽化率顯著低于對照，這與Breuer等[45]報(bào)道植物生長調(diào)節(jié)劑[（E）-5-（2-bromovinyl）-2'-deoxyuridine]對草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的殺蟲活性主要表現(xiàn)為抑制生長發(fā)育作用，顯著影響幼蟲化蛹等現(xiàn)象一致。此外，因植物中的活性成分往往存在協(xié)同或微量元素未分離獲得等原因，本研究也發(fā)現(xiàn)所分離獲得的3個(gè)活性化合物活性較低，可能是化合物間存在協(xié)同作用，也可能是含量較少的微量元素未分離獲得，故接下來的工作將進(jìn)一步對其殺蟲成分進(jìn)行進(jìn)一步的分離，并進(jìn)一步討論其構(gòu)效關(guān)系。

《“十二五”生物技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》中明確指出：“十二五”期間，開展生物農(nóng)藥、生物肥料、綠色植物生長調(diào)節(jié)劑等綠色農(nóng)用產(chǎn)品應(yīng)用的示范試點(diǎn)、普及以及研究和開發(fā)。盡管植物源生物堿在農(nóng)藥中所占份額還較小，但生物堿已經(jīng)成為未來生物農(nóng)藥發(fā)展中的一種趨勢和方向[46]。此外，鉤枝藤在國內(nèi)以海南分布最為廣泛，在廣西僅有零星分布，因此充分利用海南豐富的植物資源開發(fā)新型植物源農(nóng)藥，將為海南農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供有力的技術(shù)支撐。

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