海南龍血樹(shù)DcbHLH1的克隆與表達(dá)分析

曹天駿等

摘 要 堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic/helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子在真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。在前期龍血樹(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基礎(chǔ)上克隆了1個(gè)海南龍血樹(shù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為DcbHLH1。序列分析顯示，DcbHLH1閱讀框基因序列長(zhǎng)1 080 bp，編碼360個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為39 ku，等電點(diǎn)為8.21。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，DcbHLH1具有bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族保守的HLH結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析結(jié)果表明，DcbHLH1和中?？Х戎械腷HLH親緣關(guān)系最近。定量PCR結(jié)果表明，DcbHLH1在誘導(dǎo)劑處理后3 d內(nèi)表達(dá)量快速下降，到第6天達(dá)到最低，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)字表達(dá)譜一致。DcbHLH1在海南龍血樹(shù)的根、莖、葉等組織中均有表達(dá)，但在葉中表達(dá)量較高，根中表達(dá)量最低。結(jié)果為進(jìn)一步分析DcbHLH1在龍血樹(shù)中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 海南龍血樹(shù)；bHLH轉(zhuǎn)錄因子；克??；差異表達(dá)

中圖分類號(hào) Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Expression of DcbHLH1 in Dracaena cambodiana

CAO Tianjun1，2，DAI Haofu2， LI Huiliang2， GUO Dong2

MEI Wenli2 *， PENG Shiqing2 *

1 College of Agriculture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agricultur， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Basic/helix-loop-helix gene（bHLH）is a transcription factor in the regulation of plant growth and development. In this study， a new gene coding for bHLH， designated as DcbHLH1， was cloned using the result of RNA-seq. Sequence analysis revealed the full-length cDNA of DcbHLH1 is 1 080 bp， encoding 360 amino acid residues with molecular mass of 39 ku， and pI 8.21， predicted tertiary structure contained a structure of helix-loop-helix. Evolution analysis showed that the DcbHLH1 and bHLH of Coffea canephora were the closest relative. The results of real time PCR analysis indicated that DcbHLH1 expressed at different levels with the highest transcription in the leaf， followed by the stem， and lowest in the roots. And the transcription of DcbHLH1 was decreased strongly in the stem by injection of induction solution at 3 days and 6 days. This research lays a foundation for studying the gene expression pattern and corresponding regulating mechanisms.

Key words Dracaena cambodiana； Basic/helix-loop-helix transcription factor； Clone； Differential expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.009

血竭是一種紅色樹(shù)脂，古今中外被廣泛的應(yīng)用在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)當(dāng)中[1]。海南龍血樹(shù)（Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.）是國(guó)產(chǎn)血竭基源植物之一[2]。海南龍血樹(shù)主要分布在海南省的三亞、陵水、萬(wàn)寧等地，國(guó)外也有較少的分布。天然血竭具有廣泛的藥用活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、止血、止腹瀉、抗?jié)兊然钚訹3]?；瘜W(xué)成分分析表明，血竭中富含黃酮類物質(zhì)，如黃酮、黃烷、查爾酮、高異黃酮等[4-8]。早期的研究表明，真菌能夠誘導(dǎo)龍血樹(shù)產(chǎn)生血竭[9-10]，但對(duì)于龍血樹(shù)中這類黃酮物質(zhì)的大量產(chǎn)生和積累機(jī)理并不清楚。同時(shí)在龍血樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展過(guò)程中發(fā)現(xiàn)海南龍血樹(shù)組培苗能在6-BA刺激下產(chǎn)生血竭[11-12]。故可推測(cè)是植物體對(duì)抗外界不適宜環(huán)境所發(fā)生相應(yīng)的保護(hù)反應(yīng)產(chǎn)生的。本課題組利用自主創(chuàng)新的“無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)劑輸液法”成功誘導(dǎo)了海南龍血樹(shù)莖部黃酮物質(zhì)積累（專利申請(qǐng)中）。黃酮類物質(zhì)代謝是植物抗病機(jī)理中重要的代謝途徑。黃酮類化合物的合成底物來(lái)自于苯丙素代謝產(chǎn)生的香豆酰CoA和脂肪酸代謝產(chǎn)生的丙二酰CoA，然后經(jīng)過(guò)一系列其他骨架合成酶和結(jié)構(gòu)修飾酶的作用，形成結(jié)構(gòu)不同，活性不同的黃酮類化合物[13]。

目前對(duì)血竭的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理分析，而對(duì)血竭形成的分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道[14-15]。本課題組利用無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)劑處理海南龍血樹(shù)，并對(duì)誘導(dǎo)前后龍血樹(shù)樹(shù)干進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，旨在通過(guò)轉(zhuǎn)錄組高通量模式挖掘血竭形成的功能和調(diào)控基因，從分子水平闡明血竭的生物合成及其調(diào)控機(jī)制。本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，成功克隆了1個(gè)海南龍血樹(shù)堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic/helix-loop-helix， bHLH）轉(zhuǎn)錄因子基因DcbHLH1，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)和表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究龍血樹(shù)中bHLH轉(zhuǎn)錄因子在黃酮類生物合成途徑中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 3年生海南龍血樹(shù)種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，采集根、莖、葉后立即用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 質(zhì)粒、試劑和菌種 克隆載體pMD19T simple Vector、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 PCR Kit和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ等均購(gòu)自TaKaRa公司。E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 海南龍血樹(shù)bHLH基因的搜索和分析 對(duì)無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)劑處理前后的3年生海南龍血樹(shù)莖轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)Swissprot、非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)、非冗余的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）公共數(shù)據(jù)庫(kù)（E≤1×10-5）比對(duì)獲得了注釋結(jié)果。根據(jù)KEGG注釋的基因功能信息，對(duì)參與次生代謝的序列（按次生代謝物種類）進(jìn)行分類。再對(duì)所有注釋信息進(jìn)行整理，搜索數(shù)字表達(dá)譜中轉(zhuǎn)錄因子中變化差異較大的基因。

1.2.2 海南龍血樹(shù)總RNA的提取和cDNA合成

取健康海南龍血樹(shù)的根、莖、葉，在液氮中研磨，依據(jù)蔡文偉等[18]方法提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度儀測(cè)定含量和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補(bǔ)鏈DNA（cDNA）。

1.2.3 海南龍血樹(shù)DcbHLH1的克隆 從龍血樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得1個(gè)由13條表達(dá)序列標(biāo)簽拼接而成的1 180 bp的序列，經(jīng)注釋分析發(fā)現(xiàn)此序列是具有完整開(kāi)放閱讀框和保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，定名為DcbHLH1。依據(jù)其兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（表1），以cDNA為模板對(duì)DcbHLH1進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：在0.2 mL離心管中加入1 μL cDNA、10×PCR反應(yīng)緩沖液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化后克隆至載體pMD19T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒，測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2.4 DcbHLH1信息學(xué)分析 采用ExPASy Proteomics Server在線工具Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）對(duì)DcbHLH編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；利用http：//www.predictprotein.org/和http：//swissmodel. expasy.org/在線分析DcbHLH1二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的三維建模；利用ClustalW軟件和MEGA 5.2軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 海南龍血樹(shù)DcbHLH1的表達(dá)分析 根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)原則，在不保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)DcbHLH1的定量引物（表1），以海南龍血樹(shù)ACT基因[19]作為內(nèi)參基因，使用SYBR Green I 熒光染料法進(jìn)行分析。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系中含有5 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板（50 mg/L）0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，總體10 μL。反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性30 s， 59 ℃退火/延伸30 s，45個(gè)循環(huán)； 95 ℃變性10 s，65～95 ℃做熔解曲線分析，每個(gè)溫度以每步0.5 ℃上升，每個(gè)溫度停留5 s。試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel進(jìn)行分析，獲得DcbHLH1的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DcbHLH1的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)PCR方法獲得1個(gè)1 080 bp的DcbHLH1（圖1）。序列分析結(jié)果表明，獲得的序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

2.2 DcbHLH1編碼蛋白特性分析

DcbHLH1全長(zhǎng)1 080 bp，編碼360個(gè)氨基酸（圖2）。推導(dǎo)的DcbHLH1相對(duì)分子質(zhì)量為39 ku，等電點(diǎn)pI8.21； 帶正電殘基（Arg+Lys）為43，負(fù)電殘基（Asp+Glu）為45。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為60.74，脂肪系數(shù)為78.08，親水性系數(shù)為-0.470。二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，有73 個(gè)氨基酸參與形成α-螺旋（alpha helix），占所有氨基酸的20.33%，有32個(gè)氨基酸參與形成伸展鏈（extended strand），占總氨基酸的8.91%，另有255 個(gè)氨基酸參與形成無(wú)規(guī)則卷曲（random coil），占總氨基酸的70.75%。利用SWISS-MODEL 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，該模型有bHLH轉(zhuǎn)錄家族共有的螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)（圖3），以1nkp.2.C（1.80 A）蛋白為模板，序列同源性為30%。

2.3 DcbHLH1蛋白序列比對(duì)及進(jìn)化分析

對(duì)海南龍血樹(shù)、油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）、小果野芭蕉（Musa acuminata）、小米（Setaria italica）、荷花（Nelumbo nucifera）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、節(jié)節(jié)草（Aegilops tauschii）、蘋(píng)果（Malus domestica）、中粒咖啡（Coffea canephora）、野草莓（Fragaria vesca）等13個(gè)物種的22個(gè)bHLH進(jìn)行了同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在DcbHLH1的172到231號(hào)氨基酸存在核心的HLH結(jié)構(gòu)域（圖4）。對(duì)這22個(gè)不同物種的bHLH進(jìn)行分子進(jìn)化分析， 發(fā)現(xiàn)DcbHLH1和中?？Х菴cbHLH1的親緣關(guān)系最近，與同是單子葉植物的玉米、大麥、水稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。

2.4 DcbHLH1的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果表明，DcbHLH1在未處理的健康海南龍血樹(shù)中表達(dá)量較高，在誘導(dǎo)處理的3 d內(nèi)表達(dá)水平顯著降低，到第6天時(shí)基因表達(dá)量最低，為對(duì)照組表達(dá)水平的0.013倍（圖6）。與課題組前期的數(shù)字表達(dá)譜結(jié)果一致。DcbHLH1在所有組織中均有表達(dá)，其中在葉中表達(dá)量最高，莖次之，在根中表達(dá)量最低。

3 討論與結(jié)論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是一類含有眾多成員的重要轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)域具有與DNA結(jié)合和與bHLH蛋白形成同源或異源二聚體的能力，在植物和動(dòng)物中都有十分重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[16-19]。在植物中bHLH通常識(shí)別靶標(biāo)DNA上的E-box（由6個(gè)堿基CANNTG排列的特殊回文序列）[18]。植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子既可以作為轉(zhuǎn)錄激活子又能作為轉(zhuǎn)錄抑制子發(fā)揮生物學(xué)作用，并且作用方式多種多樣。在擬南芥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子能和R2R3類的MYB、WD40轉(zhuǎn)錄因子形成調(diào)控復(fù)合體，調(diào)控?cái)M南芥中黃酮類化合物的生物合成[16]。在玉米中也發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控種子和根中的黃酮代謝途徑[17]。Valderrama等[20]發(fā)現(xiàn)在草莓成熟過(guò)程中bHLH的表達(dá)量變化與著色變化一致，推測(cè)其在黃酮類物質(zhì)合成中起著主要的調(diào)控作用。將玉米調(diào)控莖干顏色的bHLH基因轉(zhuǎn)化到矮牽牛花中，強(qiáng)烈地促進(jìn)了植物花萼的著色[21]，表明bHLH基因參與了次生代謝調(diào)控。在蘋(píng)果和梨等果樹(shù)中， bHLH參與了低溫和紫外線誘導(dǎo)的花青苷的合成， 促進(jìn)果實(shí)著色[22-23]。另外，擬南芥中發(fā)現(xiàn)茉莉酸途徑中JAZ蛋白負(fù)調(diào)控下游bHLH（JAM1）轉(zhuǎn)錄因子活性[24]，揭示bHLH又受到植物抗逆激素信號(hào)途徑上游調(diào)控因子的作用。外界環(huán)境能通過(guò)bHLH影響植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的含量，其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究利用海南龍血樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了一個(gè)龍血樹(shù)bHLH的基因DcbHLH1。DcbHLH1具有保守的HLH結(jié)構(gòu)域，與其它植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有較高的同源性，表明該結(jié)構(gòu)域在分子進(jìn)化過(guò)程中具有較高的穩(wěn)定性，這可能與其在不同植物的生理代謝中行使同一功能相關(guān)。DcbHLH1能夠快速、顯著地響應(yīng)植物體內(nèi)微環(huán)境的變化，DcbHLH1的組織特異性表達(dá)與龍血樹(shù)中黃酮類化合物分布吻合，而DcbHLH1在處理后的表達(dá)明顯降低。bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在很多植物中都證明參與黃酮類化合物代謝的調(diào)控[25-27]，推測(cè)DcbHLH1可能作為1個(gè)負(fù)調(diào)控因子參與了龍血樹(shù)中黃酮代謝途徑。目前還未見(jiàn)到龍血樹(shù)中血竭合成調(diào)控分子機(jī)制的報(bào)道，筆者下一步將對(duì)DcbHLH1基因的功能進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步闡明DcbHLH1蛋白在海南龍血樹(shù)中血竭合成的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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