金華地區(qū)規(guī)模豬場豬鏈球菌2型的分離鑒定及特性研究

張超穎，蔣小武，沈紅霞，楊云凱，章紅兵，方維煥

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029;2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是引起斷奶仔豬死亡的重要原因之一，且可導(dǎo)致不同年齡段豬的多種疾病，如敗血癥、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、急性腦膜炎等［1］。該病原廣泛分布于世界各地規(guī)模化養(yǎng)豬地區(qū)，根據(jù)其莢膜抗原的不同可分為35 種血清型(血清型1－ 34 和血清型1/2)，其中豬鏈球菌2 型(SS2)流行最為廣泛，是一種重要的人畜共患病病原［2－3］。隨著我國豬場規(guī)模化養(yǎng)殖程度的不斷提高，作為規(guī)模豬場三大疫病之一的豬鏈球菌病已經(jīng)引起人們的重視。

為了解金華地區(qū)規(guī)模豬場健康豬群攜帶豬鏈球菌的現(xiàn)狀，本研究隨機(jī)采集了4 個規(guī)模豬場不同年齡段臨床健康豬的鼻拭子樣品，進(jìn)行豬鏈球菌的分離鑒定和生物學(xué)特性研究，旨在為該地區(qū)豬鏈球菌病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 SS2 參考強(qiáng)毒株HA9801，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陸承平教授饋贈。

1.2 試劑及器材 試驗所用培養(yǎng)基;選擇性THB培養(yǎng)基、鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基等購自青島某生物有限公司。慶大霉素等34 種常用抗生素藥敏試紙片，購自杭州某生物試劑有限公司;細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購自杭州某微生物試劑有限公司，批號20131120;Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 等購自大連某公司，PCR 引物合成于深圳某公司。試驗器材主要包括PCR 儀(Bio-Rad)、凝膠成像儀、酶標(biāo)儀(Thermo 公司)等。

1.3 試驗動物 6 周齡雌性BALB/C 小鼠購自上海某公司。

1.4 樣品采集 金華地區(qū)4 個規(guī)模豬場不同年齡、臨床表現(xiàn)健康豬(分為哺乳仔豬、保育豬、育肥豬和母豬)采集鼻拭子320份，用滅菌棉簽伸入豬只鼻腔較深處刮取黏膜表面，立即投入裝有5 mL THB液培養(yǎng)基的無菌具蓋試管中，低溫保存，2 h 內(nèi)送回微生物實驗室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 將各豬場采集的樣品于37℃增菌培養(yǎng)24h 后，無菌操作，用接種環(huán)挑取樣品劃線接種于鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h。挑取乳白色、半透明、直徑1 ～2 mm 的圓形疑似菌落，鏡檢后接種于鮮血瓊脂平板進(jìn)行純培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長情況。挑取純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及其他生物學(xué)特性試驗。

1.6 生化鑒定 挑取純培養(yǎng)物按常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗［4］，觀察并記錄結(jié)果。

1.7 血清型鑒定 參考文獻(xiàn)合成引物GDH 與cps2J，進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增鑒定SS2［5］，其中GDH 大小為688 bp，cps2J 大小為457 bp。

1.8 致病力試驗 分別將金華SS2 分離株與HA9801(陽性對照)于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.3－0.4，離心收集菌體，PBS 清洗，調(diào)整細(xì)菌濃度約為5 ×108CFU/mL(當(dāng)量于HA9801 的LD50)，并進(jìn)行10 倍連續(xù)稀釋，平板計數(shù)以確定實際接種量［6］。腹腔注射于6 周齡雌性BALB/C 小鼠，1 mL/只，每組6 只，陰性對照組注射滅菌PBS。注射后各組分別飼養(yǎng)，給予充足飲水和飼料，定時觀察記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察7 d。

1.9 藥敏試驗 用K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗［7］，用滅菌棉簽將菌液均勻涂布于鮮血瓊脂培養(yǎng)基表面，至菌液稍干后，將不同藥敏試紙片貼于培養(yǎng)基的適當(dāng)位置。37℃培養(yǎng)24 h，觀察并測定抑菌圈大小，進(jìn)行耐藥性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性及形態(tài)特點(diǎn) 經(jīng)測定，分離到的細(xì)菌在鮮血瓊脂平板上生長良好，菌落呈圓形半透明、灰白色、似針尖大小，有溶血現(xiàn)象，多數(shù)為α 溶血，部分呈β 溶血。細(xì)菌純培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見革蘭氏陽性、呈短鏈狀的藍(lán)紫色球菌，生化試驗符合豬鏈球菌特性［4］。

2.2 血清型鑒定 分離SS 疑似菌株4 株，其中SS2 型菌2 株。4 株疑似豬鏈球菌菌株雙重PCR 鑒定判定:GDH 陽性即為豬鏈球菌，GDH 與cps2J 雙陽性則為豬鏈球菌2 型(圖1)。

圖1 4 株疑似豬鏈球菌菌株的PCR 鑒定

2.3 致病力測定 接種不同SS2 菌株后，觀察1 周統(tǒng)計接種劑量及小鼠死亡數(shù)(詳見表1與圖2)。

表1 豬鏈球菌2 型分離株感染小鼠死亡率

圖2 豬鏈球菌2 型分離株感染小鼠死亡曲線

由表2、圖1可見，2 株分離菌SS2-324 與SS2-325 對小鼠具有一定致病力，但與參考強(qiáng)毒株HA9801 相比，致病力較弱，且小鼠死亡時間延后。

2.4 藥敏試驗結(jié)果 見表2。

表2 兩株豬鏈球菌2 型分離株對不同抗菌素的敏感性測定(紙片法)

由表2可見，采用34 種不同類型的抗菌素進(jìn)行藥敏試驗測定抑菌圈大小，判定不同菌株藥物敏感程度，其中2 株豬鏈球菌2 型菌株對氯霉素、氧氟沙星等大部分藥物敏感，對慶大霉素、卡那霉素等藥物出現(xiàn)不同程度耐藥，對四環(huán)素、氨曲南、多粘菌素、阿米卡星和鏈霉素完全耐藥。

3 小結(jié)與討論

鏈球菌廣泛分布于自然界，有多種血清型，主要存在于動物鼻咽部、皮膚、消化道粘膜，經(jīng)消化道和呼吸道感染。

本研究旨在對金華地區(qū)規(guī)?；i場豬鏈球菌病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，通過對疑似發(fā)病豬進(jìn)行臨床診斷、病理剖檢、病料采集及鼻拭子采樣等手段進(jìn)行豬鏈球菌病調(diào)查。

通過采集4 個規(guī)模豬場不同年齡段健康豬群的鼻拭子樣品，雖在疑似臨床病例的病料中未分離到豬鏈球菌，但在4 個豬場的鼻拭子樣品中分離到了4 株豬鏈球菌，經(jīng)PCR 方法進(jìn)行血清型鑒定發(fā)現(xiàn)其中有2 株為豬鏈球菌2 型。且4 株病菌均來自同一豬場，表明該豬場可能存在豬鏈球菌2 型的隱性感染，一旦感染其他疫病，則可能出現(xiàn)臨床癥狀。

通過對2 株豬鏈球菌2 型分離株的藥敏試驗結(jié)果顯示，對臨床常用的5 種抗菌藥物(四環(huán)素、氨曲南、多粘菌素、阿米卡星和鏈霉素)已產(chǎn)生完全耐藥，提示可能與養(yǎng)殖場長期使用該類抗菌藥物等因素有關(guān)，應(yīng)引起注意和重視。

［1］Wertheim HF，Nghia HD，Taylor W，＆ Schultsz C.Streptococcus suis:an emerging human pathogen［J］.Clinical infectious diseases:an official publication of the Infectious Diseases Society of America，2009，48(5):617－625.

［2］Feng Y，et al.Streptococcus suis infection:an emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases［J］.Virulence，2014，5(4):477－497.

［3］Wei Z，et al.Characterization of Streptococcus suis isolates from the diseased pigs in China between 2003 and 2007［J］.Veterinary microbiology，2009，137 (1－ 2):196－201.

［4］陸承平，獸醫(yī)微生物學(xué)(第四版)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.8.

［5］Tang Y，et al.Genetic and virulence characterization of Streptococcus suis type 2 isolates from swine in the provinces of Zhejiang and Henan，China［J］.Folia microbiologica，2011，56(6):541－548.

［6］Tao Chen QH，Zhaolong Li，Wei Zhang，Chengping Lu，Huochun Yao.Construction and Characterization of a Streptococcus suis Serotype 2 Recombinant Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein［J］.PloS one，2012，7(7):10.

［7］姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.2.