核酸適體檢測赭曲霉毒素A熒光方法的建立

桂海孌，金慶日，張亞軍，王曉杜，楊永春，邵春艷，程昌勇，衛(wèi)芳芳，楊 楊，楊夢華 ，宋厚輝

(浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江臨安311300)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是曲霉屬和青霉屬產(chǎn)毒菌株的次級代謝產(chǎn)物［1］，在被污染的食物和動物飼料中普遍存在，具有誘變性、免疫毒性、腎臟毒性和肝臟毒［2］。在香料、谷物、葡萄酒、動物飼料等農(nóng)畜產(chǎn)品中都可檢測到OTA 的存在［3］，并直接威脅人和動物的健康安全［4］。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品中OTA 限量為5 μg/kg，歐盟則規(guī)定牛奶、奶粉中OTA 限量為零。

目前我國檢測OTA 主要依靠薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)［5］、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［6］等。這些方法雖然具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，但使用的設(shè)備價格昂貴，樣品處理繁瑣，不適宜用于快速檢測［7］，其中酶聯(lián)免疫吸附法基于抗體識別抗原的特異性反應(yīng)，對抗體試驗要求較高，試驗周期較長，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

核酸適體(Aptamer)是一條約由20 ～100 個核苷酸組成的單鏈寡核苷酸片段，可與靶物質(zhì)特異性結(jié)合，可通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，利用連續(xù)篩選方法獲得［8］。當(dāng)靶物質(zhì)存在時，核酸適體在范德華力、堿基堆積力等作用下折疊形成特殊的三級結(jié)構(gòu)與之結(jié)合［9］。與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適體具有制備方便，易修飾，親和力高，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)［10］，在生物傳感器、熒光檢測等方面得到廣泛應(yīng)用，如量子點(diǎn)法檢測蛋白［11］，碳納米管－核酸適體傳感器［12］?，F(xiàn)有核酸適體檢測OTA 方法主要有:磁性納米顆粒法［13］，電化學(xué)法［14］等。

本試驗主要利用OTA 特異性核酸適體，利用熒光染料PicoGreen 對雙鏈核酸的特異性結(jié)合原理，建立了一種檢測OTA 的快速定量方法。PicoGreen 不結(jié)合單鏈核苷酸，僅識別并結(jié)合雙鏈DNA 的螺旋溝，繼而釋放熒光［15］。特異性的核酸適體與OTA特異性結(jié)合后，多余、未結(jié)合OTA 核酸適體與互補(bǔ)鏈雜交生成雙鏈 DNA。加入 PicoGreen 時，PicoGreen 識別溶液中的雙鏈DNA。當(dāng)PicoGreen 濃度一定時，反應(yīng)體系中加入不同濃度的OTA，則反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度不同，從而達(dá)到快速定量檢測OTA 的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 96 孔板(Costar 2592，Conning 公司);熒光檢測儀(SynergyTMH1，BioTek 公司);超純水儀(D11921，Thermo Fisher Scientific 公 司)。OTA、黃曲霉毒素B1、伏馬毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等真菌毒素(Sigma Aldrich 公司)溶于乙醇，4℃保存?zhèn)溆?PicoGreen(P7581，Life Technologies 公司)，初始濃度為200 ×。OTA 核酸適體序列［16］，OTA 核酸適體互補(bǔ)鏈序列DNA1 由生工生物工程上海股份有限公司合成(表1)。

表1 單鏈寡核苷酸名稱與序列

1.2 試驗方法

1.2.1 PicoGreen 檢測雜交雙鏈 各取50 μL 核酸適體與互補(bǔ)鏈DNA1(濃度均為10 nmol/L)于95℃加熱5 min，冰浴10 min。將核酸適體與DNA1 混勻于25℃反應(yīng)5 min［17］，加入10 μL PicoGreen 10 ×溶液避光反應(yīng)，檢測熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm)。本試驗的緩沖液為:10 mmol/L Tris，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，20 mmol/L CaCl2(pH 8.5)［18］。

1.2.2 PicoGreen 與雙鏈DNA 反應(yīng)時間優(yōu)化 取50 μL OTA 核酸適體與等體積濃度DNA1 于25℃反應(yīng)5 min，再加入10 μL PicoGreen 10 ×，熒光檢測儀內(nèi)連續(xù)檢測30 min。

1.2.3 OTA 敏感性試驗 25 μL 20 nmol/L 核酸適體與50 μL 不同質(zhì)量濃度的OTA 溶液在96 孔板內(nèi)混勻，25℃反應(yīng)20 min［19］。加入25 μL 20 nmol/L DNA1 溶液反應(yīng)5 min 后，再加入10 μL PicoGreen反應(yīng)，檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.4 OTA 核酸適體特異性試驗 分別將25 μL 20 nmol/L 核酸適體與50 μL 不同毒素反應(yīng)于25℃反應(yīng)20 min，OTA、黃曲霉毒素B1、伏馬毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮濃度均為0 ～200 μg/L。步驟同1.2.3。

1.2.5 檢測樣品試驗 同時使用本試驗非標(biāo)記熒光法與ELISA 方法檢測樣品。在含1%啤酒溶液內(nèi)添加OTA，其中20份樣品內(nèi)含有OTA，10份樣品無OTA，OTA 濃度在兩種方法的檢測范圍內(nèi)。非標(biāo)記熒光法:25 μL 20 nmol/L 核酸適體與50 μL 樣品混勻反應(yīng)，步驟同1.2.3。ELISA 操作方法:100 μL BSA－OTA(0.5 mg/L)于微孔板上4℃包被過夜，PBS洗滌3 次，加入200 μL 5%脫脂牛奶，25℃孵育1 h，PBS 洗滌3 次。檢測樣品溶液時，每孔加入100 μL 樣品混合液(24.2 mg/ L 鼠抗－OTA 溶于樣品溶液，體積比為1∶1)25℃孵育1 h，每孔再加入100 μL HRP－羊抗鼠IgG 25℃孵育1 h。每孔加入100 μL 顯色液TMB 混勻后于37℃恒溫箱內(nèi)顯色10 min，每孔加入100 μL H2SO4終止液混勻，檢測OD450nm，根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中OTA 含量。計算兩種檢測法間的Kappa 值［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理 PicoGreen 是一種定量檢測雙鏈DNA，靈敏度可達(dá)到1 μg/L 級別的熒光染料。結(jié)合雙鏈DNA 后，PicoGreen 熒光強(qiáng)度增大1000 倍以上，且不受單鏈DNA 的干擾。OTA 特異性核酸適體可識別并結(jié)合OTA(圖1)。結(jié)合OTA 后，核酸適體空間構(gòu)象會隨之發(fā)生變化，不再與其互補(bǔ)鏈結(jié)合;未與OTA 結(jié)合的核酸適體可與其互補(bǔ)鏈雜交形成雙鏈DNA。反應(yīng)體系中微量雙鏈DNA 可通過加入PicoGreen 放大熒光信號，檢測熒光強(qiáng)度，確定樣品中的OTA 濃度。

圖1 OTA 熒光檢測原理圖

2.2 PicoGreen 檢測核酸適體與互補(bǔ)鏈雜交產(chǎn)物雙鏈DNA 檢測表明，PicoGreen 檢測核酸適體與互補(bǔ)鏈的雜交產(chǎn)物時熒光強(qiáng)度最大，與Tirs 緩沖液的熒光值相比，PicoGreen 本身無熒光;單鏈DNA(核酸適體、互補(bǔ)鏈)因自身形成少量二聚體產(chǎn)生微量熒光;PicoGreen 識別雙鏈DNA 致熒光強(qiáng)度增大。因此，可用PicoGreen 檢測雙鏈DNA，核酸適體與互補(bǔ)鏈的雜交產(chǎn)物為雙鏈DNA(圖2)。

2.3 PicoGreen 與雙鏈DNA 反應(yīng)時間優(yōu)化PicoGreen 被激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度具有最大值。在核酸適體與其互補(bǔ)鏈反應(yīng)體系中加入PicoGreen 后，PicoGreen 瞬間與雙鏈DNA 結(jié)合，且在前3 min 隨反應(yīng)時間推移，熒光強(qiáng)度逐漸趨于穩(wěn)定，說明PicoGreen 與雙鏈DNA 結(jié)合已達(dá)到飽和(圖3)。在特定PicoGreen 濃度下，雙鏈DNA 越多，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，直到PicoGreen 完全結(jié)合雙鏈DNA 為止;溶液中無雙鏈DNA 時，熒光強(qiáng)度保持不變。因此，選擇熒光值達(dá)峰值3 min 時為最適反應(yīng)時間。

圖2 PicoGreen 檢測DNA

圖3 PicoGreen 與雙鏈DNA 反應(yīng)時間優(yōu)化

2.4 OTA 敏感性試驗 隨OTA 濃度增加，與OTA特異性結(jié)合的核酸適體越多，則核酸適體與互補(bǔ)鏈雜交生成的雙鏈DNA 越少，PicoGreen 識別雙鏈DNA 產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度越弱(圖4)。該法的最低檢測限為1 μg/L(1 ppb)，線性范圍為1 μg/L(1 ppb)～200 μg/L (200 ppb)，具有高靈敏度。

2.5 OTA 核酸適體特異性試驗 為了確定OTA 核酸適體與PicoGreen 方法檢測OTA 的特異性，在相同試驗條件下，比較食品及飼料中常見黃曲霉毒素B1(AFB1)、桔毒素(CTN)、伏馬毒素B1(FB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的檢測結(jié)果(圖5)。毒素濃度相同時，OTA 存在的反應(yīng)體系中釋放的熒光強(qiáng)度最弱，表明OTA 核酸適體已與OTA 特異性結(jié)合，不再與其互補(bǔ)鏈結(jié)合。因此，溶液內(nèi)無雙鏈DNA，PicoGreen 激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度最弱。其他霉菌毒素不能結(jié)合OTA 核酸適體，所以反應(yīng)體系中的核酸適體互補(bǔ)鏈可以結(jié)合核酸適體，產(chǎn)生雙鏈DNA，并結(jié)合PicoGreen 釋放出熒光。圖5說明該核酸適體能夠特異性識別OTA，與FB1，AFB1，CTN 或ZEN，且無交叉反應(yīng)。

圖4 OTA 敏感性試驗

圖5 OTA 核酸適體與PicoGreen 方法檢測OTA 的特異性分析

2.6 核酸適體熒光檢測方法與抗體ELISA 方法比較 為比較核酸適體熒光檢測方法與抗體ELISA方法之間的一致性，試驗對30份啤酒樣品進(jìn)行了檢測(表2)。利用統(tǒng)計方法計算Kappa 值為0.857 ＞0.8(95%可信度)，兩種方法的檢測結(jié)果高度一致，本方法可用于樣品檢測。

表2 熒光法與ELISA 方法比較(+陽性;－陰性)

3 小結(jié)與討論

OTA 主要污染谷物及其制品、牛奶等，嚴(yán)重危害人體和動物健康［21］。目前OTA 檢測主要采用試紙條比色法和色譜分析法［22］，對檢測樣品前期處理要求較高，且抗體制備及保存成本較高。本試驗建立的基于核酸適體與熒光染料PicoGreen 檢測OTA的新方法，為霉菌毒素檢測提供了新思路。

核酸適體是與抗體有相似功能的單鏈寡核苷酸，依靠特異性堿基識別、通過空間構(gòu)象變化結(jié)合靶分子，已被廣泛應(yīng)用于檢測領(lǐng)域。

本試驗建立的檢測方法，OTA 核酸適體特異性較強(qiáng)，與其他常見霉菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)。通過檢測PicoGreen 識別雙鏈DNA 激發(fā)產(chǎn)生的熒光峰值可減少外因干擾，實(shí)時反應(yīng)溶液OTA 量。檢測靈敏度為1 μg/L，與傳統(tǒng)常用的ELISA 法相比高度一致，Kappa 值達(dá)0.857，可在45 min 內(nèi)完成檢測。檢測方法特異性較強(qiáng)，靈敏度較高，具備快速、易操作等特點(diǎn)。

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