赤擬谷盜章魚胺受體3（TcOctβR3）cDNA克隆、表達(dá)及功能

劉小強(qiáng)，蔣紅波，李慧敏，熊英，王進(jìn)軍

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赤擬谷盜章魚胺受體3（）cDNA克隆、表達(dá)及功能

劉小強(qiáng)，蔣紅波，李慧敏，熊英，王進(jìn)軍

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲學(xué)及害蟲控制工程重慶市市級重點(diǎn)實驗室，重慶 400716）

【】章魚胺信號系統(tǒng)在調(diào)節(jié)昆蟲行為和生理過程中具有至關(guān)重要的作用。赤擬谷盜（）作為一種模式昆蟲，被廣泛用于解析昆蟲生長發(fā)育及生理等調(diào)控機(jī)制的研究工作。本研究以赤擬谷盜為對象，旨在明確章魚胺受體在調(diào)節(jié)赤擬谷盜行為和生理方面的功能?！尽扛鶕?jù)GenBank登錄的相關(guān)序列信息（XP_008198078），利用RT-PCR技術(shù)克隆赤擬谷盜章魚胺受體基因的cDNA序列。利用在線生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測該基因的開放閱讀框、編碼的氨基酸序列以及跨膜結(jié)構(gòu)域等信息，基于鄰接法構(gòu)建該基因與其他昆蟲相關(guān)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，明確系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。分別提取赤擬谷盜各發(fā)育階段（卵、幼蟲、蛹和成蟲）、不同組織（中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪體、中腸、后腸、馬氏管、精巢和卵巢）以及饑餓脅迫后的RNA，以赤擬谷盜核糖體蛋白S3（）為內(nèi)參基因，采用實時定量PCR技術(shù)分析該基因在赤擬谷盜不同發(fā)育階段、不同組織以及在饑餓脅迫下的表達(dá)模式。運(yùn)用哺乳動物異源表達(dá)系統(tǒng)在人胚胎腎細(xì)胞HEK293中瞬時表達(dá)TcOctR3，進(jìn)而利用第二信使cAMP含量測定技術(shù)分析TcOctR3與配體的結(jié)合能力。最后，通過體外合成赤擬谷盜的雙鏈RNA，利用RNA干擾以及軌跡球行為分析等技術(shù)探究該基因的生理功能?！尽啃蛄蟹治鼋Y(jié)果表明，赤擬谷盜開放閱讀框全長1 305 bp，編碼434個氨基酸，序列中含有G蛋白偶聯(lián)受體典型的7個跨膜結(jié)構(gòu)域?；卩徑臃?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)與小蜂甲（）的OctR3親緣關(guān)系最近。實時定量PCR分析結(jié)果表明，在赤擬谷盜各發(fā)育階段均有表達(dá)，尤其在低齡幼蟲期轉(zhuǎn)錄水平最高，而在其他發(fā)育階段表達(dá)量無顯著差異；在赤擬谷盜不同組織中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)量顯著高于其他組織；赤擬谷盜幼蟲在經(jīng)饑餓處理24 h的過程中，的表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢，且在處理6 h的表達(dá)量最低，為對照的0.47倍，在16 h表達(dá)量最高，為對照的1.80倍，最后恢復(fù)到正常水平。通過HEK293細(xì)胞異源表達(dá)TcOctR3后，cAMP測定結(jié)果表明章魚胺（OA）呈濃度依賴性地激活TcOctR3，其EC50為8.68×10-7mol·L-1，萘甲唑啉（NA）的激動活性最高，其有效中濃度EC50為8.56×10-8mol·L-1。4種供試生物胺激動劑活性強(qiáng)弱為：萘甲唑啉>酪胺（TA）>章魚胺>多巴胺（DA）。進(jìn)一步采用RNA干擾技術(shù)的分析結(jié)果表明，注射dsRNA能有效抑制的表達(dá)，沉默效率高達(dá)61.5%，但干擾該基因表達(dá)后不會影響赤擬谷盜成蟲的爬行速度和產(chǎn)卵量?！尽吭诔鄶M谷盜中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能發(fā)揮重要作用，能調(diào)節(jié)幼蟲對饑餓脅迫的響應(yīng)。明確了TcOctR3的分子生物學(xué)特性，可為將來以其為靶標(biāo)篩選高效激動劑和抑制劑提供理論依據(jù)。

赤擬谷盜；章魚胺受體；表達(dá)模式；生物活性；生理功能

0 引言

【研究意義】赤擬谷盜（）屬鞘翅目擬步甲科，是一類在全球范圍內(nèi)廣泛分布的倉儲害蟲。同時，因赤擬谷盜繁殖能力強(qiáng)、易于飼養(yǎng)及遺傳操作，被廣泛地用于昆蟲的生長發(fā)育、繁殖等方面的基礎(chǔ)研究。2008年，赤擬谷盜基因組測序完成[1]，進(jìn)一步推動了該蟲作為模式昆蟲的地位，同時赤擬谷盜功能基因組學(xué)等各個領(lǐng)域的研究也蓬勃發(fā)展。章魚胺（octopamine，OA）是一種在無脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)普遍存在的微量生物胺，可調(diào)控昆蟲的學(xué)習(xí)和記憶、節(jié)律、嗅覺、好斗與飛行等重要生理功能[2]。OA作為昆蟲體內(nèi)重要的神經(jīng)活性物質(zhì)（如神經(jīng)調(diào)質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)激素）[3-4]，被相應(yīng)的神經(jīng)元釋放，并通過與其受體（章魚胺受體，octopamine receptors，OctRs）結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮其生理功能[3,5]。由于章魚胺信號傳遞系統(tǒng)在昆蟲生命活動中的重要生理功能，其一直被視為新型殺蟲劑潛在的作用靶標(biāo)而備受關(guān)注。開展赤擬谷盜章魚胺受體基因分子生物學(xué)特性研究，可為進(jìn)一步深入揭示赤擬谷盜章魚胺受體的生理功能打下基礎(chǔ)，同時也將豐富對昆蟲章魚胺受體生理功能的認(rèn)識?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】章魚胺受體是典型的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）。自第一個章魚胺受體基因從黑腹果蠅（）[6]中克隆以來，研究人員在多種昆蟲中成功克隆了章魚胺受體基因，如煙草天蛾（）、家蠶（）[7]、二化螟（）[8]和橘小實蠅（）[9]等。根據(jù)章魚胺受體的氨基酸序列和信號通路與哺乳動物腎上腺素受體的相似性，目前已鑒定的章魚胺受體分為3類：-adrenergic-like octopamine receptors (OctRs)、-adrenergic-like octopamine receptors (OctRs)和octopamine/tyramine receptors（TyrRs）。在章魚胺受體的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，OctRs被激活后最初引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，同時細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸（cAMP）的濃度也會有輕微的升高[10-11]；OctRs的3種類型被激活后均能夠增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度[12]；TyrRs與脊椎動物2腎上腺素受體的結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)相似，它被Tyr激活后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的降低[13]。近年來，對于昆蟲體內(nèi)的章魚胺受體研究日益增多，Evans等[14]對其藥理學(xué)研究較為深入，對章魚胺受體特異、高效的激動劑和拮抗劑的篩選，有可能以章魚胺受體作為一種潛在的藥劑靶標(biāo)來防控害蟲[3,15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】章魚胺受體在昆蟲體內(nèi)具有重要作用，而模式昆蟲赤擬谷盜有關(guān)章魚胺受體的研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用qPCR技術(shù)，克隆赤擬谷盜cDNA全序列，解析其時空表達(dá)模式，借助異源表達(dá)系統(tǒng)和RNAi技術(shù)，明確其在昆蟲體內(nèi)的功能，豐富對昆蟲章魚胺受體生理功能的認(rèn)識。

1 材料與方法

試驗于2016年5月至2017年3月在西南大學(xué)昆蟲分子生態(tài)實驗室完成。

1.1 供試?yán)ハx與試劑

赤擬谷盜GA1品系源自美國農(nóng)業(yè)部倉儲害蟲研究課題組Richard Beeman實驗室，由河南工業(yè)大學(xué)魯玉杰教授饋贈。在實驗室內(nèi)以人工飼料（全麥粉﹕酵母粉=1﹕1），在恒溫30℃、相對濕度為60%—70%、全黑暗的條件下飼養(yǎng)。

高保真DNA聚合酶PrimerSTARTMMax Premix及PCR相關(guān)試劑均購自TakaRa公司，Trizol試劑以及細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自Life Technologies公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、克隆載體pGEM?-T Easy、T4 DNA ligase、GlosensorTMcAMP Reagent購自Promega公司，iQTMSYBR?Green Supermix購自Bio-rad公司，T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific公司，限制性內(nèi)切酶I-HF購自NEB公司，HEK293細(xì)胞、質(zhì)粒Glosensor、pcDNA3.1(+)由美國堪薩斯州州立大學(xué)Yoonseong Park教授饋贈，轉(zhuǎn)染試劑TransIT-LT1購自Mirus Bio LLC公司，PCR引物合成和測序工作均由Invitrogen公司完成。

1.2 TcOctβR3 cDNA克隆

挑取4頭赤擬谷盜第7日齡成蟲，加入Trizol試劑充分研磨，參照Trizol試劑說明書提取樣品的總RNA，使用RQ1 Rnase-Free Dnase去除基因組DNA，并經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop檢測，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank中的序列信息（XP–008198078），利用Oligo 6.0軟件和Primer premier 5.0軟件設(shè)計赤擬谷盜的全長引物（表1），并用DNAMAN 6.0對所設(shè)計的引物進(jìn)行評價。以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，采用巢式PCR擴(kuò)增，體系為25 μl：cDNA 1 μl、ddH2O 9.5 μl、PrimerSTAR Max 12.5 μl、上下游引物各1 μl。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃后延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并按照TaKaRa膠回收試劑盒回收目的條帶，將回收產(chǎn)物連接到pGEM?-T Easy載體上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌（DH5）中，過夜培養(yǎng)挑取白斑菌落，進(jìn)行菌液PCR檢測，挑選陽性克隆測序（Invitrogen）。

表1 本研究所用引物序列

1.3 序列分析

序列分析通過DNAMAN、EdiSeq等軟件完成。利用NCBI ORF finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html）確定開放閱讀框（ORF），用在線工具TMHMM（http://www.cbs.dk/services/TMHMM）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 TcOctβR3表達(dá)模式分析

赤擬谷盜不同發(fā)育階段和不同組織表達(dá)模式的樣品收集參照J(rèn)IANG等[16]方法，具體如下：不同發(fā)育階段選取早期卵（＜1 d）、晚期卵（＞2 d）、早期幼蟲（＜1 d）、老熟幼蟲（＞5齡）、早期蛹（＜1 d）、晚期蛹（＞3 d）、早期成蟲（＜1 d）、老熟成蟲（7 d）；選取羽化后7日齡未交配的成蟲解剖不同組織，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪體、中腸、后腸、馬氏管、精巢和卵巢。每個樣品3個生物重復(fù)，總RNA提取和cDNA合成參照1.2節(jié)。

根據(jù)1.2節(jié)中測序獲得的序列設(shè)計赤擬谷盜特異性qPCR引物，同時選擇赤擬谷盜核糖體蛋白S3（）為內(nèi)參基因（表1）。qPCR反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μl、GoTaq?qPCR Master Mix 10 μl、ddH2O 7 μl、上下游引物各1 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，進(jìn)行40個循環(huán)，最后95℃后延伸30 s。每次試驗技術(shù)重復(fù)3個，設(shè)置生物重復(fù)3次。利用2-??Ct法[17]對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 饑餓脅迫

分別挑取4頭正常飼養(yǎng)和饑餓處理6、12、16、24 h的赤擬谷盜孵化后10—15日齡的幼蟲，加入Trizol充分研磨，總RNA提取和cDNA合成參照1.2節(jié)，每個處理3個生物重復(fù)。

1.6 異源表達(dá)及活性測定

利用限制性內(nèi)切酶I-HF單酶切pcDNA3.1(+)載體和pGEM-T-TcOctR3質(zhì)粒，于37℃孵育20 h以保證酶切效率。反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行目的條帶分離和純化。用FastAP（Fermentas）去磷酸化，防止載體pcDNA3.1(+)自連，隨后進(jìn)行純化備用。將酶切后的目的基因與去磷酸化的pcDNA3.1(+)載體通過T4 Ligase連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5中，接種到含有氨芐青霉素（Ampicillin）的培養(yǎng)基，于37℃過夜培養(yǎng)后，在平板上挑取單菌落，PCR菌液檢測后送Invitrogene公司測序，確保獲得正確的pcDNA3.1(+)-TcOctR3重組表達(dá)質(zhì)粒。

用轉(zhuǎn)染試劑TransIT-LT1共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)- TcOctR3質(zhì)粒和GloSensor質(zhì)粒到HEK293細(xì)胞中，30 h后收集細(xì)胞?；钚詼y定參照LI等[9]的方法，略有改動。在收集的細(xì)胞中加入1% GloSensor試劑，置于磁力攪拌器上孵育2 h，利用微量滴度熒光發(fā)光檢測儀自動加樣，加50 μl細(xì)胞（濃度約為105個/50 μl）到96孔板中，然后測定化學(xué)發(fā)光值的變化。測試配體有章魚胺鹽酸鹽（OA）、萘甲唑啉鹽酸鹽（NA）、酪氨鹽酸鹽（TA）和多巴胺鹽酸鹽（DA），供試配體按照10倍濃度梯度稀釋。每個濃度設(shè)定3個技術(shù)重復(fù)和3個生物重復(fù)，在供試4種配體中，以NA在10 μmol·L-1的發(fā)光值為基準(zhǔn)，數(shù)據(jù)經(jīng)logistic模型擬合后計算有效中濃度EC50，所有計算使用Origin 8.6（OriginLab）軟件。

1.7 RNA干擾

赤擬谷盜的dsRNA特異性引物序列見表1。參照T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific）的說明書合成dsRNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后備用。dsRNA注射方法參照Bucher等[18]法。挑選化蛹時間24 h內(nèi)的蛹注射dsRNA，每頭注射200 ng（濃度為2 000 ng·μl-1），待蛹羽化5—7 d提取4頭（2雌2雄）成蟲的RNA，檢測沉默效率，注射相同體積的PBS為對照。

待蛹羽化后第5天，用昆蟲軌跡球行為記錄儀測試赤擬谷盜的爬行速度。具體的試驗方法參照使用說明書和Thiery等[19]方法。簡言之，在測試的過程中，球體轉(zhuǎn)動的方向與昆蟲爬行的方向相反，但是速度始終保持一致。連續(xù)記錄2 min，用TrackSphere軟件處理數(shù)據(jù)。羽化第7天，將雌蟲和雄蟲單對配對放入裝有面粉、直徑3.5 cm的塑料養(yǎng)蟲盒中，飼養(yǎng)5 d后記錄每頭雌蟲的產(chǎn)卵量[20]，共處理25對。所得產(chǎn)卵量使用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 赤擬谷盜TcOctβR3序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

利用RT-PCR技術(shù)，克隆獲得了赤擬谷盜cDNA全長序列（GenBank登錄號：XP–008198078）。cDNA全長1 305 bp，編碼434個氨基酸。TMHMM 2.0蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件分析結(jié)果表明，具有7個螺旋跨膜區(qū)（圖1），是典型的G蛋白偶聯(lián)受體。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，跨膜區(qū)氨基酸的位置分別位于第49—71、83—105、125—147、167—189、209—231、346—368和383—405位，且每一個跨膜域都包含23個氨基酸。該序列與鞘翅目、雙翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目和膜翅目等6個目昆蟲的章魚胺受體進(jìn)行同源性比較分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示，與所有類受體聚為一簇，并且與紅斑尼埋葬甲（）及小蜂甲（）等類受體關(guān)系較近。

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2.2 TcOctβR3表達(dá)模式

在赤擬谷盜的不同發(fā)育階段包括卵、幼蟲、蛹和成蟲中均有所表達(dá)，在幼蟲期的表達(dá)水平最高（圖3-A）。在所測定的成蟲各組織中也均有所表達(dá)，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)量最高，其余組織表達(dá)量從高到低依次為精巢、脂肪體、卵巢、后腸、中腸和馬氏管（圖3-B）。

2.3 TcOctβR3在饑餓脅迫下的表達(dá)模式

赤擬谷盜幼蟲在饑餓脅迫下，表達(dá)量發(fā)生明顯變化（圖4）。饑餓6 h，的相對表達(dá)量為0.47，極顯著低于對照（＜0.01）；隨著饑餓時間不斷延長，的表達(dá)量逐漸上升，在16 h最大達(dá)1.80，顯著高于對照（＜0.05）；饑餓24 h后，表達(dá)量又恢復(fù)到正常水平。

2.4 TcOctβR3活性測定

HEK293細(xì)胞異源表達(dá)TcOctR3后，4種供試生物胺均能呈濃度依耐性激活TcOctR3，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP的變化（圖5）。其中，NA對該受體的激動活性最高，其有效中濃度EC50為8.56×10-8mol·L-1，而模式配體OA的激動劑活性相對較弱，EC50為8.68×10-7mol·L-1，TA和DA的EC50分別為4.92×10-7、1.22×10-5mol·L-1。因此，4種供試配體激動活性由強(qiáng)到弱為NA＞TA＞OA＞DA。

2.5 RNA干擾后表型觀察

采用半定量和實時定量PCR技術(shù)分析了注射dsOctR3后的表達(dá)變化情況（圖6-A、6-B），結(jié)果顯示，注射dsOctR3后，靶標(biāo)基因的表達(dá)量極顯著下調(diào)（＜0.01），與注射PBS相比，沉默效率為61.5%。同時，赤擬谷盜羽化后第5天，用昆蟲軌跡球行為記錄儀測定試蟲的爬行速度，結(jié)果顯示，注射dsOctR3試蟲的平均爬行速度為10.30 mm·s-1，注射PBS試蟲的平均爬行速度為11.61 mm·s-1，二者無顯著差異（＞0.05）（圖6-C）。在羽化后第7天進(jìn)行雌雄配對，結(jié)果顯示（圖6-D），注射dsOctR3后，赤擬谷盜雌蟲在5 d內(nèi)的平均產(chǎn)卵量為35粒，而對照的產(chǎn)卵量為32粒，二者亦無顯著差異（＞0.05）。

生物胺受體來源及GenBank登錄號：The origin of the amine receptors and their GenBank accession numbers。紅斑尼埋葬甲Nicrophorus vespilloides NvesOctβR1 (AHN85841.1), NvesOctβR2 (AHN85842.1), NvesOctβR3 (AHN85843.1), NvesOctR1 (AHN85844.1), NvesTAR1 (AHN85845.1), NvesTAR2 (AHN85846.1), NvesDAR1 (XP_017775810.1), NvesDAR2 (XP_017775018.1)；豌豆蚜Acyrthosiphon pisum ApisOctβR1 (XP_001947781.1), ApisOctβR3 (XP_001948521.2), ApisOctR1 (XP_016658387.1)；黑腹果蠅Drosophila melanogaster DmelOctβR1 (Q9VCZ3.1), DmelOctβR2 (Q4LBB9.2), DmelOctβR3 (Q4LBB6.4), DmelOctR1 (NP_732541.1), DmelTAR1 (BAB71788.1), DmelTAR2 (NP_650652.1), DmelDAR1 (CAA54451.1)；家蠶Bombyx mori BmorOctβR2 (BAJ06526.1), BmorOctR1 (BAF33393.1), BmorTAR1 (BAD11157.1), BmorTAR2 (BAI52937.1), BmorDAR1 (NP_001108459.1), BmorDAR2 (NP_001108338.1)；岡比亞按蚊Anopheles gambiae AgamOctR1 (EAA06361.5)；小蜂甲Aethina tumida AtumOctβR3 (XP_019864626.1)；意大利蜜蜂Apis mellifera AmelOctR1 (NP_001011565.1)；沙漠蝗Schistocerca gregaria SgreOctβR2 (ADD91575.1)；赤擬谷盜Tribolium castaneum TcasOctβR1 (NP_001280514.1), TcasOctβR2 (NP_001280501.1), TcasOctβR3 (XP_008198078.1), TcasTAR1 (NP_001164312.1), TcasDAR1 (NP_001280543.1), TcasDAR2 (NP_001280503.1)。標(biāo)尺代表遺傳距離 The scale in the figure represents genetic distance

EE：早期卵Early egg；OE：老熟卵Old egg；EL：早期幼蟲Early larva；OL：老熟幼蟲Old larva；EP：早期蛹Early pupa；OP：老熟蛹Old pupa；EA：早期成蟲Early adult；OA：老熟成蟲Old adult；CNS：中樞神經(jīng)系統(tǒng)Central nervous system；FB：脂肪體Fat body；HG：后腸Hindgut；MG：中腸Midgut；MT：馬氏管 Malpighian tubule；OV：卵巢Ovary；TE：精巢Testis。柱上不同的字母表示經(jīng)Duncan新復(fù)極差測驗比較后差異顯著Different letters on the bar indicate significant difference by Duncan’s multiple range tests (P＜0.05)

*：在P＜0.05水平差異顯著significant difference at P＜0.05 level；**：在P＜0.01水平差異顯著significant difference at P＜0.01 level

圖5 4種配體對表達(dá)TcOctβR3細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響

3 討論

本研究克隆獲得了赤擬谷盜cDNA序列，預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)有7個螺旋跨膜區(qū)域，屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體，預(yù)示在調(diào)控赤擬谷盜生理活動過程中具有重要作用。通過與其他昆蟲章魚胺受體氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，赤擬谷盜、紅斑尼埋葬甲、小蜂甲等昆蟲的單獨(dú)聚為一簇，這種結(jié)果可能是由它們的親緣關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)決定的。

A：半定量檢測RNA干擾后TcOctβR3的相對表達(dá)量 Semi-quantitative RT-PCR detection of TcOctβR3 levels after RNA interference；B：實時熒光定量分析RNA干擾后TcOctβR3的轉(zhuǎn)錄水平，以注射PBS的相對表達(dá)量作為基準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。**表示t 檢驗存在顯著差異（P＜0.01）qRT-PCR analysis of TcOctβR3 transcriptional level after RNA interference. With relative expression after injecting phosphate-buffered saline (PBS) as a benchmark for statistical analysis. ** indicates significant difference at P＜0.01 level by Student t-test；C：注射dsOctβR3后赤擬谷盜成蟲爬行速度的變化，t檢驗無顯著性差異（P＞0.05）The changes of the walking speed of T. castaneum adult after dsOctβR3 injection. There is no significant difference by Student t-test (P＞0.05)；D：注射dsOctβR3后赤擬谷盜產(chǎn)卵量的變化，t檢驗無顯著性差異（P＞0.05）The changes of egg numbers of T. castaneum after dsOctβR3 injection. There is no significant difference by Student t-test (P＞0.05)

本研究發(fā)現(xiàn)在赤擬谷盜不同發(fā)育階段均有所表達(dá)，尤其在幼蟲期高表達(dá)，這與棉鈴蟲（）[21]、二化螟[8]體內(nèi)的表達(dá)模式相似，暗示章魚胺在幼蟲階段發(fā)揮重要的作用。在赤擬谷盜成蟲不同組織中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)量占主導(dǎo)地位，表明該受體可能在神經(jīng)系統(tǒng)扮演著重要角色。在黑腹果蠅中，主要在腦部高表達(dá)[22]，在沙漠蝗（）體內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)，而在飛行肌高表達(dá)[23]，這預(yù)示著不同類型的章魚胺受體承擔(dān)著不同的生理功能。近年來一些研究表明，在饑餓條件下，昆蟲體內(nèi)血淋巴中章魚胺含量會發(fā)生明顯變化，同時活躍度也會增加[24-25]。與此相似，橘小實蠅在饑餓條件下表達(dá)量顯著上調(diào)[9]，暗示章魚胺受體在饑餓調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示，赤擬谷盜幼蟲在饑餓過程中，表達(dá)量起初呈現(xiàn)出顯著性下調(diào)，而后又顯著性上調(diào)，最后恢復(fù)正常水平，暗示參與了饑餓調(diào)節(jié)過程。

赤擬谷盜是一種世界性倉儲害蟲，可通過系統(tǒng)RNAi研究其基因的功能[26]。沉默赤擬谷盜，成蟲爬行速度與對照相比并無顯著性差異，這一結(jié)果與[27]、[22]在胸部肌肉組織低表達(dá)相似，表明可能不參與昆蟲的運(yùn)動過程。注射dsOctR3后，雌蟲產(chǎn)卵量不受影響，這一結(jié)果與在卵巢中的表達(dá)模式相似[27]，預(yù)示可能與產(chǎn)卵無關(guān)。

近年來，對于昆蟲體內(nèi)章魚胺受體的藥理學(xué)研究日益增多，很多對章魚胺受體有高度特異的激動劑和拮抗劑用于害蟲的防治，例如殺蟲脒和雙甲脒[3]，同時它們可以作為增效劑來篩選新型藥劑，可有效防治埃及伊蚊（）幼蟲[15]。借助異源表達(dá)系統(tǒng)，類章魚胺受體的活性在多種昆蟲中得到驗證，如DmOctR3與DmOctR1活性相似，激動劑活性均為NA＞OA，而DmOctR2則是OA＞NA[14]，對于BdOctR1，激動劑活性為NA＞OA[9]。本研究測試配體對TcOctR3的激動劑活性發(fā)現(xiàn)強(qiáng)弱為NA＞OA，與DmOctR3相似[14]。OA對赤擬谷盜TcOctR3有效中濃度EC50為8.68×10-7mol·L-1，其激動活性弱于果蠅DmOctR3, EC50為1.40×10-8mol·L-1[12]，這種結(jié)果可能是由于不同昆蟲OctR3敏感差異所致。

目前對章魚胺受體的亞型是如何調(diào)節(jié)章魚胺的研究具有局限性，對果蠅、家蠶類受體研究較多，而對鞘翅目昆蟲章魚胺受體的研究極少，僅Cunningham等闡釋了亞社會性昆蟲紅斑尼埋葬甲6種章魚胺受體基因的表達(dá)模式[27-28]，而在鞘翅目模式昆蟲赤擬谷盜則未見報道。本研究從生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄方面分析了赤擬谷盜的一些基本特性，豐富了對昆蟲章魚胺受體生理功能的認(rèn)識。由于章魚胺在昆蟲體內(nèi)重要的生理作用及其在脊椎動物中含量極少的特性，以其受體為靶標(biāo)將有助于開發(fā)出更為高效安全的新型藥劑[29]。因此，對赤擬谷盜和其他受體的功能和調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

赤擬谷盜為典型的G蛋白偶聯(lián)受體，其基因的表達(dá)具有發(fā)育階段和組織特異性，主要在幼蟲期和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)；可能參與饑餓調(diào)節(jié)過程，但與運(yùn)動和產(chǎn)卵無關(guān)；章魚胺可有效激活TcOctR3，表明具有良好的控制劑靶標(biāo)潛力。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

The cDNA Cloning, expression profiling and functional characterization of octopamine receptor 3 () in

LIU XiaoQiang, JIANG HongBo, LI HuiMin, XIONG Ying, WANG JinJun

(Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering of Chongqing, College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716)

【】Octopaminergic signaling system plays a crucial role in the reregulation of behavioral and physiological processes in insects. The red flour beetle () is a model insect which has been widely used in the study of insect growth, development and physiology. The objective of this study is to utilizeas the research insect and elucidate the vital functions of octopamine receptors involved in the physiology and behavior【】Based on the sequence information in GenBank (XP_008198078), the cDNA of an octopamine receptor () was cloned by RT-PCR. The open reading frame (ORF), deduced amino acid sequence and the membrane structure domains were predicted by using online service, and phylogenetic tree associated withfrom other insects was constructed by using neighbor-joining method to clarity its phylogenetic relationship. In addition, the RNA was extracted from different developmental stages (egg, larva, pupa, and adult), different tissues (central nervous system, fat body, midgut, hindgut, malpighian tubule, testis and ovary), as well as the larvae under stress of starvation, respectively. Ribosomal protein S3 gene () was used as an internal reference. qRT-PCR (real-time quantitative PCR) was employed to determine its expression patterns in different developmental stages, different tissues as well as the induced expression profiles under the stress of starvation. TcOctR3 was transiently expressed in human embryonic renal cell (HEK293) by using heterologous expression system, and cAMP measuring method was performed to determine the activity of its ability to combine with ligands. Finally, the double stranded RNA ofwas synthesized, and the physiological functions were verified by track ball behavior analysis as well as RNA interference (RNAi) technology. 【】 A complete sequence ofwas cloned with open reading frame (ORF) of 1 305 bp, encoding 434 amino acids, with a signature of 7 transmembrane domains which belongs to the superfamily of G-protein coupled receptors. This gene exhibited a close relationship with thefrombased on neighbor-joining phylogenetic tree. qRT-PCR results indicated thatwas expressed at all tested developmental stages, particularly high at the early larval stage. However, the expression ofwas not significantly different from other developmental stages. Besides, the expression ofwas remarkably higher in the central nervous system (CNS) than that in other tissues. In the process of starvation for 24 h, the expression ofsignificantly fluctuated and then returned to the normal level. The lowest expression ofwas 0.47 fold at 6 h and the highest expression was 1.80 folds at 16 h compared with control, respectively. Based on cyclic AMP response assay, it was found that TcOctR3 could be activated by octopamine (OA) in a dose-dependent manner with a median effective concentration (EC50) of 8.68×10-7mol·L-1after heterogenous expression in HEK293 cells. Naphazoline (NA) strongly activated this receptor with EC50of 8.56×10-8mol·L-1compared with other ligands. Generally, the rank order for the potency of 4 tested ligands was naphazoline＞tyramine (TA)＞octopamine＞dopamine (DA). RNAi results indicated that the transcript level ofwas significantly knocked down 61.5% by injected the targeted dsRNA. However, no effect on the walking speed and fecundity ofadults was observed. 【】plays an important role in the central nervous system, which modulates the response of the beetle larvae upon starvation. The molecular characterizations were determined based on a cAMP assay, which will provide a solid basis for the future screening of its high efficiency agonists and inhibitors.

; octopamine receptor; expression profile; biological activity; physiological function

2017-10-30；

2017-11-24

國家自然科學(xué)基金面上項目（31772233）

劉小強(qiáng)，E-mail：liukf@foxmail.com。

王進(jìn)軍，E-mail：wangjinjun@swu.edu.cn