Fas途徑調(diào)控芬太尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)合誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡

王志學(xué) 張曉俠 雷 燕 李 艷 蘇天亮

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，河北 承德 067000)

近年來，腫瘤綜合治療的實(shí)施使乳腺癌的死亡率逐年下降，癌痛治療愈顯重要。前期研究證實(shí)〔1～3〕，一定濃度的嗎啡、5-氟尿嘧啶(5-FU)及聯(lián)合應(yīng)用48 h對(duì)人乳頭癌細(xì)胞株MCF-7有促進(jìn)凋亡作用，并顯著上調(diào)Fas表達(dá)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-8活性，兩藥聯(lián)合應(yīng)用啟動(dòng)外源性凋亡途徑具有協(xié)同作用，并且與其中嗎啡的濃度有一定的劑量依賴關(guān)系。報(bào)道顯示〔4～6〕，芬太尼對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞劑量依賴性地抑制增殖、促進(jìn)凋亡，顯著減少腫瘤細(xì)胞所致的組織破壞。本文旨在探討芬太尼與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin VEGFP)，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;碘化丙啶(PI)，美國Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基，GIBCOBRL公司;胎牛血清，天津血液學(xué)研究所;胰蛋白酶，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司;鼠抗人Fas及Caspase-8、Western印跡單克隆抗體，福州邁新生物技術(shù)有限公司;β-actin一抗、山羊抗鼠Western印跡二抗，美國Santa Cruz公司。YT-CJ-1N超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心;FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國B＆D公司;CO2電熱恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司;LD5-IA低速離心機(jī)，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司;QL-901振蕩器，中國其林貝爾;熒光倒置顯微鏡，日本尼康;光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 芬太尼注射液，宜昌人福藥業(yè);5-FU注射液，上海旭東海普藥業(yè)。MCF-7，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇成功后，調(diào)整濃度為1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶，靜置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。觀察待貼壁70% ～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 共分為8組，分別用含不同藥物的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。U組(未處理組)即對(duì)照組，LF組為0.1μmol/L，MF組為1μmol/L，HF組為10μmol/L芬太尼處理組，F(xiàn)U組為 500μmol/L 5-FU處理組，LF+FU組為0.1μmol/L芬太尼與500μmol/L 5-FU聯(lián)合處理組，MF+FU組為1μmol/L芬太尼與500μmol/L 5-FU聯(lián)合處理組，HF+FU組為10μmol/L芬太尼與500μmol/L 5-FU聯(lián)合處理組。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)Annexin V-EGFP/PI染色的細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約5×105/ml接種于25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，其貼壁后更換為含不同藥物的培養(yǎng)液(詳見1.2.2)5 ml，每組5瓶，孵育48 h。屆時(shí)吸棄上清，消化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，收集細(xì)胞(約106/ml以上)于離心管;4℃低速離心緩沖液1 500 r/min、5 min后棄上清，重懸于500μl的 Binding Bufferr溶液，加入 5μl Annexin V-EGFP及5μl PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min;1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 Western印跡檢測(cè)Fas、Caspase-8表達(dá) 另取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以5×105/ml接種于25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，其貼壁后更換含不同藥物的培養(yǎng)液(詳見1.2.2)，每組5瓶，孵育48 h。充分裂解，4℃高速離心，取上清－80℃保存。二喹啉甲酸(BCA)法行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定;煮沸變性、冰浴;蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入Fas及Caspase-8一抗、β-actin一抗，4℃孵育過夜。洗膜，加入二抗，室溫2 h。曝光、定影、掃描，軟件分析目的條帶的灰度值及相應(yīng)β-actin條帶的灰度值，以兩者比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)資料以x±s表示，進(jìn)行單因素方差分析與析因設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn);實(shí)驗(yàn)組Fas、Caspase-8變化作Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組凋亡率變化情況 與U組相比，單獨(dú)應(yīng)用芬太尼處理時(shí)1μmol/L及10μmol/L組均引起凋亡率增加(P＜0.05，P＜0.01)，單獨(dú)應(yīng)用500μmol/L 5-FU后凋亡率亦明顯增加(P＜0.01);芬太尼與5-FU聯(lián)合應(yīng)用，各組較單獨(dú)應(yīng)用5-FU或該濃度芬太尼單獨(dú)應(yīng)用相比，凋亡率均明顯增加，且均具有協(xié)同作用(P＜0.01)。且凋亡率隨其中芬太尼濃度增加依次增加。見表1。

表1 處理48 h各組細(xì)胞凋亡率及Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)情況(x±s，n=5)

2.2 Fas、Caspase-8表達(dá)情況 與U組相比，單獨(dú)應(yīng)用芬太尼處理1μmol/L及10μmol/L組均引起Fas、Caspase-8表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05，P＜0.01)，500 μmol/L 5-FU 單獨(dú)應(yīng)用后 Fas、Caspase-8表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01);芬太尼與5-FU聯(lián)合應(yīng)用，各組較單獨(dú)應(yīng)用5-FU或該濃度芬太尼單獨(dú)應(yīng)用相比，F(xiàn)as、Caspase-8表達(dá)均明顯增強(qiáng)，且均具有協(xié)同作用(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組Caspase-8活性變化與實(shí)驗(yàn)組Fas抗原表達(dá)變化作Pearson相關(guān)分析表明兩者之間呈顯著正相關(guān)(r=0.877，P＜0.01)。見表1。

3 討論

阿片類藥物通過多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞生長，芬太尼抑制腫瘤生長的機(jī)制之一即是誘導(dǎo)凋亡〔4～6〕?；熤械某Ｓ盟幬?-FU可通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡亦早已證實(shí)。

對(duì)人類來說，誘導(dǎo)凋亡主要有外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑又稱死亡受體途徑，是通過細(xì)胞膜上的死亡受體，最典型的是Fas糖蛋白和腫瘤壞死因子(TNF)受體I激活，一旦細(xì)胞受到某些凋亡信號(hào)刺激，F(xiàn)as被Fas-L占據(jù)后會(huì)導(dǎo)致受體聚合，向Fas表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)傳遞死亡信號(hào)，通過其死亡相關(guān)域蛋白(FADD)DED結(jié)構(gòu)域募集并激活Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)，進(jìn)而觸發(fā)Caspase酶系級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔7，8〕。阿片樣物質(zhì)可促進(jìn)Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡早在1999 年就被 Yin 等〔9〕提出，Tegeder等〔10〕又檢測(cè)出嗎啡對(duì)MCF-7和MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞處理后均引起Fas表達(dá)增加。而后，Yin等〔11〕又證實(shí)了嗎啡誘導(dǎo)的多種腫瘤細(xì)胞株凋亡或壞死，其機(jī)制之一可能就是激活Fas/FasL基因家族等一系列信號(hào)通路，通過促凋亡的FADD/P53通路和抗凋亡P13K/Art/核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通路綜合作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用1μmol/L、10μmol/L芬太尼處理時(shí)，通過顯著上調(diào)Fas表達(dá)、Caspase-8激活，啟動(dòng)外源性凋亡途徑來誘導(dǎo)凋亡。5-FU可能通過激活Caspase、上調(diào)Fas受體的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的治療機(jī)制亦早已證實(shí)〔12，13〕，本研究結(jié)果中單獨(dú)應(yīng)用500μmol/L 5-FU后顯著上調(diào)Fas表達(dá)、Caspase-8激活也正與此吻合。說明兩藥聯(lián)合應(yīng)用可能在通過死亡受體途徑發(fā)揮協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這無疑為與化療同時(shí)實(shí)施的阿片類藥物癌痛治療增加了信心，另外其研究結(jié)果也可為乳腺癌患者手術(shù)麻醉及術(shù)后鎮(zhèn)痛制定合理方案提供一定的理論依據(jù)。

1 王志學(xué)，孫立新，宋有鑫，等.不同濃度嗎啡與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響〔J〕．廣東醫(yī)學(xué)，2012;33(19):2881-4.

2 王志學(xué)，孫立新，李汝泓，等.不同濃度的嗎啡與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2012;32(15):3223-6.

3 王志學(xué)，劉新偉，李汝泓，等.不同濃度嗎啡與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用通過Fas途徑誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡的體外研究〔J〕．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013;29(8):1212-4.

4 張咸偉，丁漢琳，張傳漢，等.芬太尼MCF-7細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期影響研究〔J〕．中國醫(yī)師雜志，2005;7(1):23-5.

5 丁漢琳，張咸偉，張傳漢.芬太尼影響MCF-7細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2004;20(12):1351-3.

6 El Mouedden M，Meert TF.The impact of the opioids fentanyl and morphine on nociception and bone destruction in a murine model of bone cancer pain〔J〕．Pharmacol Biochem Behav，2007;87(1):30-40.

7 Gu Q，Wang JD，Xia HH，et al.Activation of the caspase-8/Bid and Bax pathways in aspirin-induced apoptosis in gastric cancer〔J〕．Carcinogenesis，2005;26(3):541-6.

8 Hacker G，Weber A.BH3-only proteins trigger cytochrome c release，but how〔J〕?Arch Biochem Biophys，2007;462(2):150-5.

9 Yin D，Mufson RA，Wang R，et al.Fas-mediated cell death promoted by opioids〔J〕．Natrure，1999;397(6716):218.

10 Tegeder I，Grosch S，Schmidtko A，et al.G protein-independence G1cell cycle block and apoptosis with morphine in adenocarcinoma cell:in-volvement of p53 phosphorylation〔J〕．Cancer Res，2003;63(8):1846-52.

11 Yin D，Woodruff M，Zhang Y，et al.Morphine promotes Jurkat cell apoptosis through pro-apoptotic FADD/P53 and anti-apoptotic P13K/Art/NF-kappaB pathway〔J〕．JNeuroimmunol，2006;174(1-2):101-7.

12 Johnstone R，Ruefli A，Lowe S，et al.Apoptosis:a link between cancer genetics and chemotherapy〔J〕．Cell，2002;108(2):153-64.

13 Eichhorst ST，Muerkoster S，Weigand MA，et al.The chemotherapeutic drug 5-fluorouracil induces apoptosis in mouse thymocytes in vivo via activation of the CD95(APO-1/Fas)system〔J〕．Cancer Res，2001;61(1):243-8.