清利活血湯配合三黃生肌紗條對糖尿病足潰瘍大鼠血漿及肉芽組織中白介素-1、內皮素-1及一氧化氮含量的影響

段旭東 趙 輝 高 璇 張雅蘭 王曉媛

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院外科，河北 石家莊 050000)

糖尿病足(DF)潰瘍最常見的是難以愈合的足部潰瘍。目前普遍認為DF是一個全身性疾病，它既有內科疾病的臨床表現，又有肢端潰爛，局部感染等外科疾病的癥狀和體征，所以在其治療上，要重視內外科綜合治療〔1〕。我科采用清利活血湯配合三黃生肌紗條治療DF多年，取得了良好的臨床療效。本實驗觀察二者對DF潰瘍大鼠血漿及肉芽組織中白介素(IL)-1、內皮素(ET)-1、一氧化氮(NO)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠32只，體重180～220 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:1103043，室溫20℃飼養(yǎng)，自由進食水。

1.2 藥物

1.2.1 清利活血湯 黃芪20，山藥15 g，當歸12 g，桃仁9 g，紅花 9 g，川芎 9 g，山楂 6 g，生地 9 g，玄參 20 g，蒼術 9 g，銀花12 g，黃連6 g，土元6 g，魚腥草15 g，上藥加水1 000毫升，浸泡2 h，武火煮開，文火煎煮15 min，將藥液倒出，加水500 ml，煎煮15 min，將藥液倒出與第一次藥液混合，使用前濃縮成含2.42 g生藥/ml的混懸液。冷藏保存。

1.2.2 三黃生肌紗條 黃連、黃柏、姜黃、當歸各15 g，生地30 g等，麻油500 g浸藥3 d微火煎熬至藥枯，去藥渣后加入黃蠟30 g，微火化開，浸入滅菌紗布條，低溫儲存待用。

1.2.3 鹽酸二甲雙胍片 北京中惠藥業(yè)有限公司產品，批準文號:國藥準字H19983069。批號20101112，0.25 g/片。

1.3 主要儀器及試劑 高壓液相分析，VARIANT-2美國伯樂公司產品。酶聯免疫檢測儀，MK3，芬蘭雷勃公司產品。全自動洗板機8×12，美國寶特公司產品。電熱恒溫水箱，600型，天津泰斯特公司產品。可見光分光光度計，722型，上海分析儀器廠產品。超低溫保存箱，MDF-382E，日本 SANYO公司產品。高速冷凍離心機，1-15 K，美國Sigma公司產品。電動玻璃勻漿機，DY89-1，寧波新芝生物科技股份有限公司產品。高性能無菌實驗臺，DL-CJ-1N，哈爾濱東聯電子技術開發(fā)有限公司產品。電子天平，HM-200，日本島津公司產品。鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司產品，批號S-0130。

1.4 分組及模型建立 大鼠隨機分為四組，每組8只，隨機抽取1組為正常組，普通飼料喂養(yǎng)，余組高脂飼料喂養(yǎng)，4 w后禁食不禁水16 h，一次性腹腔注射低劑量 STZ 30 mg/kg(用pH4.4的無菌檸檬酸緩沖液配成0.25%濃度);正常對照組腹腔注射等體積的0.1 mol/L無菌檸檬酸緩沖液，72 h后斷尾取血，測定血糖，血糖＞16.65 mmol/L者為成模大鼠，選取糖尿病大鼠按照血糖隨機分為模型組、清利活血湯治療組(治療組)、二甲雙胍治療對照組(對照組)，每組8只。四組動物在空腹8 h后均以10%水合氯醛1 ml/100 g體重腹腔注射麻醉，背部剃毛，常規(guī)消毒，用打孔器于大鼠背部脊柱左側相同部位打孔(φ2 cm)，潰瘍深及筋膜層，止血，以相同大小塑料環(huán)縫于皮膚上以阻止皮膚收縮，無菌紗布包扎，分籠飼養(yǎng)，自由飲水與進食，用藥期間所有糖尿病大鼠繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)。

1.5 用藥 治療組及對照組均從模型建立后第1天開始灌胃給藥，2 ml/次，1 次/d，共 15 d，用藥劑量按有關公式〔2〕，將人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量，模型組、正常組均生理鹽水灌胃，2 ml/次，1次/d，共15 d。各組大鼠均從手術后第1天起，每日清創(chuàng)1次，祛除創(chuàng)面上硬痂，常規(guī)消毒，用生理鹽水沖洗創(chuàng)面。治療組以三黃生肌紗條外敷，對照組用凡士林紗條外敷，正常組、模型組以生理鹽水紗條外敷。創(chuàng)面外用無菌紗布包扎，膠布固定。

1.6 檢測樣品的制備

1.6.1 肉芽組織勻漿的制備 分別取肉芽組織2 g生理鹽水沖洗3次，剪碎后移入高速勻漿器中，加入4℃生理鹽水4 ml，高速研磨2 min，使組織充分勻漿，制備好的勻漿置離心機3 000 r/min離心15 min，提取上清液備用。

1.6.2 血漿的制備 10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔內注射麻醉后，切斷大鼠右股動脈取血，2 000 r/min離心2 min分離血漿備用。

1.7 檢測指標及方法

1.7.1 糖化血紅蛋白 (HbA1c)測定 各取2 ml大鼠血置EDTA抗凝管內，采用高壓液相法測定HbA1c含量。

1.7.2 血漿及肉芽組織IL-1、ET-1的測定 采用放射免疫法，分別取肉芽組織勻漿及血漿0．1 ml，先由自動γ-放射免疫計數器預先編制程序，直接給出標準曲線及濃度，然后分別測定IL-1、ET-1含量，同時測得組織勻漿上清液蛋白含量。

1.7.3 血漿及肉芽組織 NO測定 分別取樣品0.3 ml，按試劑盒要求步驟操作，最后置紫外可見分光光度計550 nm、0.5 cm光徑檢測各管吸光度值。

1.8 統(tǒng)計學處理 數據采用x±s表示，用STATA8.0統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析及q檢驗。相關分析采用直線相關性檢驗。

2 結果

2.1 大鼠HbA1c的變化 與正常組比較，模型組大鼠HbA1c明顯增高〔(18.15±1.86)%vs(6.48±1.28)%，P＜0.01〕，與模型組比較，治療組〔(12.88±2.77)%〕及對照組〔(15.01±1.64)%〕HbA1c均明顯降低(P＜0.01)，治療組HbA1c較對照組低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 大鼠血漿及創(chuàng)面肉芽組織IL-1含量的變化 表1可見，與正常組比較，模型組大鼠血漿及肉芽組織中IL-1含量明顯增高(P＜0.01)，與模型組比較，治療組及對照組IL-1均較模型組明顯降低(P＜0.01);與對照組比較，治療組血漿及肉芽組織中IL-1明顯降低(P＜0.05)。見表1。血漿與肉芽組織中IL-1顯著正相關(r=8.10，P＜0.01)。

2.3 大鼠血漿及創(chuàng)面肉芽組織ET-1含量的變化 與正常組比較，模型組大鼠血漿及肉芽組織中ET-1含量明顯增高(P＜0.01);與模型組比較，治療組及對照組ET-1均較模型組明顯降低(P＜0.01)，與對照組比較，治療組血漿及肉芽組織中ET-1明顯降低(P＜0.01)。見表1。血漿與肉芽組織中ET-1顯著正相關(r=10.406，P＜0.01)。

表1 各組大鼠血漿、內芽組織IL-1、ET-1、NO含量 (x±s，n=8)

2.4 大鼠血漿及創(chuàng)面肉芽組織NO含量的變化 與正常組比較，模型組大鼠血漿及肉芽組織中 NO含量明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，治療組NO含量較模型組明顯升高(P＜0.01)，對照組NO含量雖有升高，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與對照組相比，治療組NO含量明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，見表1。血漿與肉芽組織中 NO顯著正相關(r=10.335，P＜0.01)。

3 討論

潰瘍面的修復過程含炎癥、增生和修飾三個階段，有多種細胞、介質、生長因子和細胞外基質等成分的共同參與。研究發(fā)現，在DF潰瘍中，生長因子和其他傷口愈合所需要的介質發(fā)生異?！?，4〕，從而影響傷口愈合。因此深入研究這些因子在DF潰瘍中的變化及作用，有助于揭示潰瘍難以愈合的機制。

IL-1是典型的炎癥細胞因子，幾乎各種有核細胞均能產生，其既擔任著內源性免疫防御的重要職能，同時也是參與組織破壞和纖維化的效應分子，不同的情況，不同的細胞，不同的濃度，IL-1的作用可能不同，甚至完全相反〔5〕。研究表明，高血糖可激發(fā)IL-1 mRNA自身正反饋機制產生大量IL-1，而大量的IL-1可誘導胰島β凋亡導致高血糖〔6，7〕，形成惡性循環(huán)從而加重糖尿病病情。同時DF潰瘍面上IL-1顯著增高可抑制了成纖維細胞的增殖，從而使?jié)冸y以愈合。降低潰瘍面上IL-1含量，可加速創(chuàng)面愈合〔8〕。本實驗提示清利活血湯三黃生肌紗條促進愈合的機理可能與抑制大鼠體內過度的炎癥反應有關。

ET、NO是血管內皮細胞釋放的一組作用相反的生物活性因子，對維持血管正常的生理功能(形態(tài)、通透性、收縮與舒張功能)起著重要作用。

糖尿病時由于高糖等因素引起血管內皮細胞受損，ET-NO系統(tǒng)失調，并最終導致糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生〔9，10〕。兩者間動態(tài)失衡的程度可在一定程度上反映糖尿病患者血管壁的異常，血管內皮細胞損害程度。ET-1是目前已知的作用最強和維持時間最持久的一種縮血管物質。研究表明，血管內皮功能的改變是糖尿病血管并發(fā)癥的始發(fā)因素，高血糖狀態(tài)會損傷血管內皮細胞引起大量的ET釋放〔11〕，從而使局部血管處于持續(xù)收縮狀態(tài)，刺激血管平滑肌細胞增生，血小板凝聚，單核細胞變成泡沫細胞，形成粥樣斑塊，繼發(fā)血栓，出現相應的肢體缺血表現。而高血糖所導致的高糖毒性，糖基化終末產物、體內自由基含量增加等因素加速NO滅活及NO活性異常，使NO含量減少，其擴張血管、松弛血管平滑肌和抑制內皮細胞增殖的作用降低。NO正常生理功能的減弱或喪失，可能激活單核細胞、白細胞、血小板向內皮聚集，并加快血小板的凝集，結果導致脂蛋白流入并透過內皮促進平滑肌增殖、血管阻塞〔12〕。近年來的研究提示潰瘍面高濃度 ET-1阻礙肉芽生長、潰瘍面愈合〔13，14〕。本研究顯示清利活血湯加三黃生肌紗條促進愈合的機制可能與減少血管內皮細胞的損傷有關。

DF潰瘍屬中醫(yī)“潰瘍”、“脫疽”、“消渴”等范疇，中醫(yī)學認為本病的發(fā)病機制主要是消渴日久，氣陰兩虛，經脈瘀阻，血行不暢，肢端失養(yǎng)，加之濕熱下注，久之則肢端壞死。故治療上應采用益氣養(yǎng)陰，活血通絡清熱利濕的治療方法，清利活血湯中黃芪、山藥、生地益氣養(yǎng)陰，當歸桃仁、紅花川芎養(yǎng)血活血，玄參、蒼術、銀花、黃連、土元、魚腥草清熱利濕，土鱉蟲咸寒歸肝經，有破瘀血、續(xù)筋骨功效，現代研究表明土鱉蟲具有較好的降血糖、血脂作用〔15〕;三黃生肌紗條在我科臨床應用多年，具有良好的清熱活血生肌斂瘡的作用〔16〕。內外相和，清利活血生肌斂瘡，可較好地加速DF潰瘍面的愈合。

綜上，清利活血湯內服配合三黃生肌紗條外用可降低DF潰瘍創(chuàng)面血漿及肉芽組織中ET-1、IL-1含量、提高NO含量從而促進潰瘍愈合。

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