表觀遺傳修飾炎癥相關(guān)基因在高血糖“代謝記憶”中的作用及機制

徐 瑾 廖云飛 衷誠群 楊 娟

(宜昌市第二人民醫(yī)院 三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443000)

早期高血糖導(dǎo)致的血管損傷在血糖控制至正常水平后仍持續(xù)存在，并成為后期血管病變發(fā)生發(fā)展的重要致病因素之一;而在早期控制高血糖至理想水平，則可以延緩甚至阻斷血管并發(fā)癥的形成;這一現(xiàn)象被稱之為高血糖“代謝記憶”〔1〕。已有研究證明，高血糖的“代謝記憶”可被靶細胞的表觀遺傳改變〔2〕。本文分析表觀遺傳修飾炎癥相關(guān)基因在高血糖“代謝記憶”中的作用及相關(guān)機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠 購自南京君科生物工程有限公司，均為雄性，6周齡，體重150～170 g，60只大鼠隨機分為正常對照組、高糖組、代謝記憶組各20只。其中高糖組采用鏈脲佐菌素(STZ)溶液腹腔內(nèi)注射，高糖狀態(tài)持續(xù)24 w;代謝記憶組采用STZ溶液腹腔內(nèi)注射，誘導(dǎo)成模后高糖狀態(tài)持續(xù)12 w后，隨后使用胰島素控制血糖至正常范圍，胰島素正常狀態(tài)持續(xù)12 w。

1.2 實驗試劑和儀器 主要實驗試劑:細胞、組織總RNA提取試劑盒、STZ、Luciginin、apocynin、L-NAME、DPI購自美國 Sigma公司、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SsoAdvanced實時定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司、超氧化物陰離子熒光條件(DHE)和活性氧簇細胞滲透性指示劑(CM-H2DCFDA)購自美國 Life technologies公司、內(nèi)源性一氧化氮合酶(eNOS)抗體和PhosphoeNOS(Serl177)抗體購自美國CST公司。

主要實驗儀器:CFX96實時PGR儀和ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司、F-4500熒光分光光度計購自美國Themo公司、Olympus 1X71倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司、Amexa Nucleofector核酸電轉(zhuǎn)染儀購自德國Amexa公司。

1.3 實驗方法 造模喂養(yǎng)24 w后，麻醉處死大鼠，解剖分離大鼠主動脈組織，清除主動脈組織周圍結(jié)締組織及血污，將游離主動脈送往氧化應(yīng)激及NO生物活性檢測，操作如下:取15 mg主動脈組織置入250μl裂解液中，將其研磨粉碎，將15μl蛋白酶K及550μl RNase-free ddH2O滴入研磨后漿液中，56℃溫箱內(nèi)靜置15 min，1 500 r/min離心，取上清。將0.5倍體積無水乙醇滴入上清液中，混合均勻，將溶液轉(zhuǎn)入CR3吸附柱中，1 500 r/min離心，棄廢液，收回吸附柱;將300μl去蛋白液RW1加入置CR3吸附柱內(nèi)，1 500 r/min離心，棄廢液，收回吸附柱;再依次將75μl DNaseI工作液、350μl去蛋白液RW1及450μl漂洗液RW加入到CR3吸附柱內(nèi)，同上離心、棄廢液，收回吸附柱操作，最終將吸附柱置于新離心管內(nèi)，加入60μl RNase-free ddH2O，靜置5 min，1 500 r/min離心，最終得到RNA溶液。取2μl RNA溶液置于分光光度計內(nèi)檢測，記錄單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、細胞間黏附分子(ICAM)-1、IL-6 mRNA表達水平、eNOS基因表達和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平。NO活性水平、活性氧(ROS)水平檢測選用熒光探針檢測，操作嚴格按儀器說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組主動脈血管內(nèi)皮功能對比 正常對照組NO含量顯著高于高糖組和代謝記憶組，而MCP-1、ICAM-1和IL-6 mRNA表達則顯著低于高糖組和代謝記憶組(P＜0.01);代謝記憶組NO含量顯著高于高糖組，而MCP-1、ICAM-1和IL-6 mRNA表達則顯著低于高糖組(P＜0.01)。見表1。

2.2 3組主動脈血管組織ROS水平對比 正常對照組DHE和CM-H2DCFDA熒光強度顯著低于高糖組和代謝記憶組(P＜0.01);代謝記憶組的DHE和CM-H2DCFDA熒光強度顯著低于高糖組(P＜0.01)。見表1。

表1 3組主動脈血管內(nèi)皮功能、血管組織ROS水平對比(x±s，n=20)

2.3 3組主動脈血管組織eNOS基因表達和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平比較 正常對照組eNOSmRNA和蛋白表達水平顯著低于高糖組和代謝記憶組，而Ser-1177磷酸化水平顯著高于高糖組和代謝記憶組(P＜0.01);代謝記憶組的eNOSmRNA和蛋白表達水平顯著低于高糖組，而Ser-1177磷酸化水平顯著高于高糖組(P＜0.01)。見表2。

表2 3組主動脈血管組織eNOS基因表達和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平比較(x±s，n=20，%正常對照組)

3 討論

表觀遺傳特指基因于核苷酸序列不變的情況下出現(xiàn)表達活性的可遺傳性改變，其具有無DNA序列變化、可遺傳，并且可能引發(fā)基因活性及功能變化的特征。表觀遺傳變化誘因可能表現(xiàn)為環(huán)境、飲食以及藥物影響等〔3〕。表觀遺傳可以對基因表達激活或者抑制進行修飾及調(diào)節(jié)，早期大鼠的高血糖可誘導(dǎo)血管eNOS基因出現(xiàn)表觀遺傳，大鼠eNOS表達活性出現(xiàn)改變。而血管eNOS則可生成一種有效的血管張力調(diào)節(jié)物質(zhì)——NO，該物質(zhì)是目前已知的唯一血管舒張因子，其可介導(dǎo)血管舒張，還具有抑制平滑肌細胞增生、抗白細胞黏附及血小板聚集等功效〔4〕。血管內(nèi)皮細胞損傷是糖尿病患者血管相關(guān)并發(fā)癥的根本發(fā)病機制，血管內(nèi)皮障礙也被臨床確定為糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的早期征兆。糖尿病相關(guān)血管并發(fā)癥患者及動脈粥樣硬化患者其eNOS的NO合成水平均顯著低于正常人群，因此，NO水平也成為臨床衡量患者內(nèi)皮功能損傷程度的重要標(biāo)志物〔5〕。本研究也證實了上述結(jié)論。eNOS的活性可通過多個磷酸化反映位點調(diào)節(jié)，Ser-1177正是其中重要的一個位點〔6〕。高糖可導(dǎo)致Ser-1177磷酸化水平下降，進而導(dǎo)致NO合成水平下降，并阻斷細胞己糖胺途徑，進一步抑制eNOS活性。本研究表明高糖組和代謝記憶組內(nèi)皮功能損傷更為嚴重。

MCP-1是趨化因子的一種，其可于動脈粥樣硬化早期將單核細胞趨化至血管壁內(nèi);ICAM-1是具有較強的促單核細胞黏附血管內(nèi)皮細胞作用的炎癥因子〔7〕;IL-6是淋巴因子的一種，其具有增強細胞氧化應(yīng)激壓力，提高細胞通透性的功效，此外，IL-6還可抑制NO的血管擴張反應(yīng)，導(dǎo)致患者內(nèi)皮功能失調(diào)嚴重化〔8〕。本研究提示高糖組和代謝記憶組大鼠均存在較為明顯的內(nèi)皮功能異常癥狀，但控制血糖后內(nèi)皮功能可有明顯改善。早期的高血糖給內(nèi)皮細胞造成了持久性的損傷“記憶”。

ROS是氧化應(yīng)激重要參與物質(zhì)之一，而氧化應(yīng)激已被臨床確定為糖尿病并發(fā)癥重要形成機制，ROS可通過多途徑參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展，如激活蛋白激酶C，誘導(dǎo)晚期糖基化終末產(chǎn)物生產(chǎn)，激活氨基己糖通路等〔9〕。DHE和 CMH2DCFDA熒光強度是反映ROS表達水平的重要檢測手段，其強度與ROS表達水平呈正相關(guān)〔10〕。

綜上，早期高血糖對血管內(nèi)皮細胞功能存在極大損傷，即使血糖水平恢復(fù)正常，其eNOS表達依然較高，即出現(xiàn)高血糖代謝記憶。

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5 Pirola L，Balcerczyk A，Okabe J，et al.Epigenetic phenomena linked to diabetic complications〔J〕．Nature Rev Endocrinol，2010;6(12):665-75.

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7 Cho YM，Kim TH，Lim S.Type2 diabetes-associated genetic variants discovered in the recent genome-wide association studies are related to gestational diabetes mellitus in the Korean population〔J〕．Diabetologia，2009;52(2):253-61.

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9 王燕飛，侯 粲，蘇 欣，等．組蛋白乙酰化與糖尿病〔J〕．中華內(nèi)分泌代謝雜志，2014;30(2):167-70．

10 黃 焱，陳 婷，杜 濤，等．糖尿病大鼠晶狀體高糖代謝記憶機制的研究〔J〕．中國實用眼科雜志，2014;32(3):375-8．