何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺磷酸化cyclinD1蛋白表達的影響

葛志華 崔宙開 楊 寧 李俊玫 王春艷 于海忠 楊佳寧

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院科研處，河北 承德 067000)

細胞周期素D1(cyclinD1)是細胞周期的正調(diào)節(jié)因子，cyclinD1可以和CDK4/CDK6形成復合物并產(chǎn)生蛋白激酶活性，促進G1/S期的轉(zhuǎn)變，加快細胞周期進程。目前，關于cyclinD1過度表達導致細胞失控、癌變的研究很多，而對于cyclinD1與衰老的研究較少。孫潔等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)菟絲子醇提液可通過影響細胞調(diào)控因子p16、cyclinD1表達延緩肝細胞衰老。本文觀察何首烏飲對下頜下腺磷酸化cyclin D1的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 OLYMPUS顯微鏡(日本)，VT1000S振蕩切片機(德國Leica公司)，何首烏飲方劑由炙何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓六味中藥組成，藥物均購自承德富爾康藥業(yè)有限公司，磷酸化cyclinD1抗體(上海邁新生物科技有限公司)。

1.2 何首烏飲給藥方法 高、中、低劑量何首烏飲分別為，3.872、1.936 及 0.968 g·100 g－1· d－1，分別水煎濃 縮 成0.6 ml·100 g－1·d－1，灌胃，1 次/d。

1.3 實驗動物分組 選用8周齡清潔級SD雌性大鼠90只，體重180～220 g(河北省實驗動物中心，合格證編號:605106)，隨機分為預防性和治療性兩大實驗，預防性實驗分為正常組、模型組、何首烏飲預防高、中、低劑量組，治療性實驗分為陰性對照組、自然恢復組、何首烏飲治療高、中、低劑量組，每組9只。

1.4 各組動物的處理 預防性實驗部分:正常組大鼠正常喂養(yǎng) 60 d。模型組腹腔注射 D-半乳糖 0.5 ml·100 g－1·d－1，1次/d，連續(xù)60 d。何首烏飲預防高、中、低劑量組大鼠腹腔注射D-半乳糖的同時分別用高、中、低劑量何首烏飲灌胃，1次/d，連續(xù)60 d。治療性實驗部分:陰性對照組稱重后按0.5 ml·100 mg－1·d－1腹腔注射生理鹽水，1 次/d，連續(xù) 60 d 后改為生理鹽水灌胃(0.6 ml·100 g－1·d－1)60 d;另外4組用 D-半乳糖腹腔注射，1次/d，連續(xù)60 d后，取其中3組作為何首烏飲治療高、中、低劑量組每天分別用高、中、低劑量何首烏飲灌胃，連續(xù)60 d;另一組衰老模型作為自然恢復組正常喂養(yǎng)60 d。

1.5 取材、固定及切片的制備 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉后，開胸，經(jīng)左心室插管入主動脈，生理鹽水沖凈血液后4%多聚甲醛灌注、固定取雙側(cè)下頜下腺，4%多聚甲醛后固定過夜。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片，片厚6μm，每隔30張取相鄰5張，裱于APES處理過的載玻片上，置于37℃溫箱干燥后進行脫蠟、蘇木精-伊紅染色、去除組織蛋白等處理，操作完成后封片。

1.6 細胞計數(shù) 磷酸化cyclinD1陽性顆粒呈黃色或棕黃色，對磷酸化cyclinD1免疫細胞化學染色的切片，在400倍顯微鏡下進行陽性細胞計數(shù)。每只動物取3張切片，每一切片隨機檢查3個視野，計算細胞中陽性細胞率。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結果

磷酸化cyclinD1在正常及實驗組大鼠下頜下腺的腺泡細胞、顆粒曲管及其他導管上皮細胞中均有表達，磷酸化cyclinD1陽性顆粒散在分布于細胞質(zhì)內(nèi)，呈黃色或棕黃色(圖1)。表1可見，預防性實驗部分的組間磷酸化cyclinD1蛋白的表達比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，正常組最高，模型組最低，各預防組中以預防中劑量組效果最好(P＜0.01)。治療性實驗部分的組間磷酸化cyclinD1蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，陰性對照組最高，自然恢復組最低，各治療組中以治療中劑量組最高(P＜0.01)。

表1 各組大鼠下頜下腺磷酸化cyclinD1的表達(x±s，n=9)

圖1 各組大鼠下顎下腺磷酸化cyclin D1表達(SDAB，×400)

3 討論

機體衰老是不可避免的自然現(xiàn)象。衰老時，細胞的增殖能力減退，甚至完全停滯，使功能細胞難以更新，臟器萎縮、功能衰退。細胞周期停滯是細胞衰老的一個關鍵特征。細胞周期的進程受細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(CDKI)等調(diào)控因子及之間的相互作用調(diào)節(jié)。細胞周期蛋白在每次間期時被合成，而在有絲分裂時被降解，呈周期性的波動。細胞周期蛋白與細胞衰老關系密切。目前已發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白有十多種，哺乳動物細胞中的 cyclin 分 A、B、C、D(D1、D2、D3)、E 、F、H，其中 cyclinD 是 G1期周期蛋白，在G1期或G1/S期交界處發(fā)揮作用，與細胞周期蛋白依賴性激酶 CDK4/CDK6形成復合體催化 RB蛋白磷酸化，Rb蛋白磷酸化后失活，釋放E2F，游離的E2F啟動G1/S期轉(zhuǎn)換相關基因表達，推動細胞周期的進程。如果抑制cyclinD在G1期表達，細胞將不能進入S期〔2〕。cyclinD過度表達時則可縮短G1期間隔降低細胞對促細胞分裂劑的依賴性〔3〕。

衰老細胞中，一些與細胞周期有關的蛋白質(zhì)的表達多降低，如cdk2，G2-cyclin(cyclin A 及 B)以及 c-fos、AP-1的表達均降低。對G1-cyclin(cyclin C、D及E)的表達雖無影響，但有研究表明〔4〕，在衰老的人成纖維細胞中CDKI因子增多，cyclinDm-RNA水平比休眠細胞高很多倍，這必然導致過量的cyclinD產(chǎn)生，但多為無活性的cyclinD/CDK4復合物，而磷酸化cyclinD卻比休眠細胞少得多，而只有這種磷酸化的cyclinD才可以提高復合物的活性。有活性cyclinD/CDK4復合物少，使Rb蛋白不能磷酸化，則細胞不能通過“R”限制點而阻滯于G1期〔5〕。另有研究表明，衰老細胞中雖然CDK2總磷酸化水平不變，但cyclinD、E-CDK中的磷酸化水平卻下降，從而導致細胞停滯于G1期〔4〕。本實驗說明何首烏飲可能通過促進cyclinD蛋白磷酸化阻斷cyclinD/CDK4-CDK6-/Rb/E2F途徑對Rb蛋白的磷酸化，促進細胞增殖，延緩衰老，其中以預防中劑量組效果最好。

1 孫 潔，李 晶，歐 芹，等.菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝細胞p16和cyclinD1基因表達的影響〔J〕．中國老年學雜志，2011;31(21):4208-10.

2 溫進坤，韓 梅.醫(yī)學分子生物學(理論與研究技術)〔M〕．北京:科學出版社，2010:357-73.

3 Shan NG，Trivedi TI，Tankshali RA，et al．Stat3 expression in oral squamous cell carcinoma:association with clinicopathological parameters and survival〔J〕．Int J Biol Markers，2006;21(1):175-83.

4 Dulic V，Drullinger LF，Lees E，et al．Altered regulation of G1 cyclins in senescent human diploid fibroblasts:accumulation of inactive cyclin ECdk2 and cyclin D1-Cdk2 complexes〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，1993;90(23):11034-8.

5 Stein GH，Dulic V.Origins of G1 arrest in senescent human fibroblasts〔J〕．Bioessay，1995;17(6):537-43.