神經(jīng)生長(zhǎng)因子和蝮蛇抗栓酶對(duì)腦梗死大鼠海馬神經(jīng)元一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)元的影響

張 曄 周酈楠

(遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110101)

心腦血管疾病具有致殘率高、死亡率高、發(fā)病率高的特點(diǎn)，好發(fā)于50歲以上的中老年人，已嚴(yán)重威脅到人類的身體健康。如今，在我國(guó)有2.7億余人患有心腦血管疾病，患病人數(shù)還在繼續(xù)上升，其中多發(fā)性腦梗死(MCI)占的比重最大。因此，對(duì)多發(fā)性腦梗死發(fā)病機(jī)制及治療措施的研究在提高患者生活質(zhì)量等方面發(fā)揮了重要作用。本文探討神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和蝮蛇抗栓酯(Svate-3)對(duì)MCI大鼠海馬神經(jīng)元一氧化氮合酶(nNOS)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 注射用神經(jīng)活素(神經(jīng)生長(zhǎng)因子，NGF)及精制蝮蛇抗栓酶(Svate-3)購(gòu)于中外合資大連斯威特制藥有限公司;還原型輔酶Ⅱ購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司;硝基四氮唑藍(lán)及三羥甲基氨基甲烷購(gòu)于中國(guó)上海前進(jìn)試劑廠。

1.2 動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠(由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)60只。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組20只、模型組20只及治療組20只。各組在第1天和第7天分別取材10只。

1.3 MCI模型制備 將麻醉(1%戊巴比妥鈉，40 ml/kg)后的大鼠在頸部正中切開(kāi)、剝離，充分暴露處左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及其分叉處;用動(dòng)脈夾對(duì)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端進(jìn)行無(wú)損傷夾閉;用眼科直剪在頸外動(dòng)脈上剪一小口，逆行插入套管針并固定，拔出針芯，開(kāi)放頸內(nèi)動(dòng)脈處的動(dòng)脈夾，注入肝素鹽水0.2 ml(含肝素10 IU)以及微小栓子懸濁液0.5 ml(25 g/L);注射完畢后，結(jié)扎頸外動(dòng)脈剪口處的近心端，開(kāi)放頸總動(dòng)脈處動(dòng)脈夾，使栓子通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)。最后，逐層縫合進(jìn)行觀察〔1～3〕。

1.4 術(shù)后處理 術(shù)后模型組用1 ml·100 g－1·d－1生理鹽水灌胃。治療組肌肉注射 NGF 500 BU·ml－1·d－1;尾靜脈注射Svate-3 0.025 U·200 g－1·d－1，連續(xù) 7 d。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分 于第1天和第7天進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，參照Longa等〔4〕的神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 取材切片 將麻醉(1%戊巴比妥鈉，40 ml/kg)后的大鼠開(kāi)胸，經(jīng)升主動(dòng)脈對(duì)大鼠進(jìn)行內(nèi)固定灌注(用0.1 mol/L PBS配置的4%多聚甲醛固定液)，結(jié)束后，端頭迅速取出腦組織，置入同種固定液中4 h，然后將腦組織切成薄塊，并放置在20%蔗糖溶液中脫水，于4℃冰箱內(nèi)保存，直至腦組織薄塊下沉，取出作冠狀位連續(xù)冰凍切片〔5〕，片厚20μm。

1.7 尼氏染色 冰凍切片自冰箱內(nèi)取出，室溫晾干，用0.1 mol/L PBS將切片漂洗3次(5 min/次)，然后將切片置于10 g/L的甲苯胺藍(lán)溶液中(37℃，90 min)，取出后，用蒸餾水進(jìn)行沖洗，再用0.1 mol/L PBS將切片漂洗3次(5 min/次)。常規(guī)脫水、透明、封片，置于光鏡下觀察。

1.8 NOS免疫組織化學(xué)染色 用0.1 mol/L PBS徹底漂洗切片;室溫下，在0.2%TritonX-100 PBS溶液中預(yù)孵育10 min;37℃下，在孵育液(NADPH-d 10 mg，NBT 5 mg，Triton X-100 0.03 ml，用 pH=7.4的0.1 mol/L磷酸鹽緩液溶液配置成100 ml)中反應(yīng)2～3 h;用0.1 mol/L PBS終止反應(yīng)，并漂洗3次(1 min/次)。常規(guī)脫水、透明、封片。利用顯微圖像分析儀，對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)單位面積內(nèi)形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整的存活神經(jīng)元數(shù)及nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重(g)變化 第1天，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重?zé)o差異。第7天，正常對(duì)照組與第1天比較體重略有下降但無(wú)顯著差異(P＞0.05);模型組和治療組體重下降明顯(P＜0.01);治療組與模型組比較體重有所增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重變化(x±s，n=10，g)

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定 第1天，正常對(duì)照組無(wú)神經(jīng)功能的改變;模型組(2.50±1.08)和治療組(2.40±0.70)大鼠均產(chǎn)生不同程度的神經(jīng)功能障礙(P＜0.01)，但模型組與治療組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。第7天，治療組(1.20±0.92)與模型組(2.30±0.95)相比較有差異(P＜0.05)。模型組第1天與第7天神經(jīng)功能無(wú)明顯差異，治療組第1天與第7天比較有顯著差異(P＜0.01)。

2.3 尼氏染色結(jié)果 第1天，正常對(duì)照組尼氏染色切片上，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量較多，排列緊密并且形態(tài)完整、分布均勻，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)豐富的尼氏體，染色正常。第7天，模型組大鼠海馬CA1區(qū)切片上，可見(jiàn)少量神經(jīng)元存活，有散亂無(wú)規(guī)則狀的細(xì)胞碎片。第1天，模型組與治療組神經(jīng)元數(shù)較正常對(duì)照組明顯減少(P＜0.01)。第7天，治療組與模型組比較神經(jīng)元數(shù)量顯著增多(P＜0.01)。治療組與同組第1天比較神經(jīng)元明顯增多(P＜0.01)，與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量(x±s，n=10)

2.4 NOS免疫組化結(jié)果 正常對(duì)照組NOS陽(yáng)性反應(yīng)物呈藍(lán)色，主要集中在胞質(zhì)和突起，胞核不著色。第1天，模型組大鼠海馬CA1區(qū)切片上，陽(yáng)性神經(jīng)元呈圓形或卵圓形的胞體，著色較深，突起較少;治療組大鼠海馬CA1區(qū)切片上，陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較模型組少，胞體呈圓形，胞體著色較淺，突起不明顯。第7天，模型組大鼠海馬CA1區(qū)切片上，陽(yáng)性神經(jīng)元分布稀疏，神經(jīng)元的胞體呈圓形，胞體著色較淺，突起少;治療組大鼠海馬CA1區(qū)切片上可見(jiàn)胞體著色較模型組深，胞體呈圓形或橢圓形，突起可見(jiàn)。第1天，模型組與治療組nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較正常對(duì)照組明顯增多(P＜0.01);治療組與模型組比較nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少(P＜0.01)。第7天，模型組與正常對(duì)照組比較nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少(P＜0.01)，治療組接近正常對(duì)照組nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量(P＞0.05)。治療組第7天與第1天比較nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量(x±s，n=10)

3 討論

一氧化氮(NO)是一種重要血管活性物質(zhì)，最早在血管內(nèi)皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其有局部血流調(diào)節(jié)的作用〔6〕，作為一種重要信使分子，雖然NO的化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但它卻能以相對(duì)特異的方式參與腦的多種生理病理過(guò)程〔7〕。

NO參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦組織內(nèi)的許多生理功能:它能夠促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放;參與突觸可塑性的形成;參與了視覺(jué)、疼痛及氣味區(qū)分;調(diào)節(jié)了血腦屏障的通透性;參與到學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程;還參與到長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化〔8〕。Kato等〔9〕認(rèn)為，NO 的局部釋放能調(diào)節(jié)海馬 CA1 區(qū)的LTP閾值，激活NMDA受體釋放NO，抑制LTP。

一氧化氮合酶(NOS)可以將精氨酸中的氮原子，在氧氣(O2)及其他輔助因素參與下合成NO。因此，多數(shù)實(shí)驗(yàn)同過(guò)對(duì)NOS的研究來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)NO作用的研究〔10〕。研究表明，NO參與了缺血性腦損傷的病理生理過(guò)程〔11〕。在此過(guò)程中，NO既有神經(jīng)毒性又發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用〔12〕。NO的神經(jīng)保護(hù)作用表現(xiàn)在:①擴(kuò)張血管，促進(jìn)微循環(huán)，增加腦部血流量;②通過(guò)抑制血小板和白細(xì)胞的聚集，從而對(duì)血管內(nèi)膜起到了保護(hù);③抑制了由腎上腺素等物質(zhì)產(chǎn)生的血管收縮，從而可以減輕缺血性腦損傷〔13〕。NO的神經(jīng)毒性作用表現(xiàn)在:①大量羥自由基和二氧化氮自由基引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸及脂肪膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用，從而引起神經(jīng)元死亡〔14〕;②神經(jīng)毒性的產(chǎn)生是NO通過(guò)形成NO-鐵復(fù)合物、巰基蛋白的氧化，形成超氧陰離子等方式實(shí)現(xiàn)的〔13〕。③神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡是由NO產(chǎn)生的ONOO-使線粒體內(nèi)的錳超氧化物歧化酶失活，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)O2

-增多引發(fā)的。腦缺血早期，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和nNOS表達(dá)水平都有所升高，其中eNOS產(chǎn)生的大量NO對(duì)腦有神經(jīng)保護(hù)作用，但擴(kuò)張腦血管的時(shí)間非常短暫，2 h后eNOS表達(dá)水平下降，對(duì)腦不再有保護(hù)作用;雖然nNOS比eNOS產(chǎn)生的NO少，但此種NO對(duì)腦有神經(jīng)毒性作用。隨著缺血時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，NO主要來(lái)源于nNOS。本實(shí)驗(yàn)提示NGF和Svate-3對(duì)多發(fā)性腦梗死具有很好的治療效果。

1 周酈楠，張 曄，張 暉.CGRP對(duì)多梗死大鼠海馬CA4區(qū)NPY細(xì)胞影響的研究〔J〕．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010;5(18):13-4.

2 李冬梅，王 戈.多發(fā)性腦梗塞動(dòng)物模型的研究及分析〔J〕．內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014;29(3):57-8.

3 張 曄，張 艷，周酈楠.多發(fā)性腦梗死大鼠乳頭體一氧化氮合酶改變〔J〕．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2012;7(6):37-8.

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕．Stroke，1989;10(1):84-91.

5 包新民，舒思云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕．北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:38-57.

6 王志浩，張岫美.一氧化氮與缺血性腦血管疾病〔J〕．國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2005;25(5):466-70.

7 陳 琳，高 署，胡成穆，等.一氧化氮及一氧化氮合酶在腦缺血損傷中的作用〔J〕．安徽醫(yī)藥，2004;8(1):3-6.

8 包新民，舒斯云，曾建新.大鼠全腦缺血后紋狀體邊緣區(qū)內(nèi)一氧化氮合酶、神經(jīng)肽Y表達(dá)的變化〔J〕．第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001;21(9):644-7.

9 Kato K，Zorumski CF.Nitric oxide inhibitors facilitate the induction of hippocampal long-term potentiation by modulating NMDA responses〔J〕．JNeurophysiol，1993;70(3):1260-3.

10 Faraci FM，Brian JE.Nitric oxide and the cerebral circulation〔J〕．Stroke，1994;25(3):692-703.

11 Nishimura M，Izumiya Y，Higuchi A，et al．Adiponectin prevents cerebral ischemic injury through endothelia nitric oxide synthase dependent mechanisms〔J〕．Circulation，2008;117(2):84-91.

12 Adams JA，Wu D，Bassuk J，et al．Nitric oxide synthase isoform inhibition before whole body is chemia reperfusion in pigs:vital or protective〔J〕?Resrscitation，2007;74(3):516-25.

13 陳俊拋，鄭文權(quán)，田時(shí)雨，等.大鼠腦缺血時(shí)腦組織中NOS1陽(yáng)性神經(jīng)元變化的連續(xù)觀察〔J〕．臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，1998;11(6):323-5.

14 商秀麗，趙久晗，薛一雪.腦缺血再灌注大鼠模型eNOS和nNOS的變化〔J〕．中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010;19(1):49-52.