補腎益智方對實驗性阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶水平的影響

于 濤 賴世隆

(廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性的記憶和認知功能嚴重減退為主的老年期或老年前期發(fā)病的大腦變性疾病，中醫(yī)在治療此類疾病積累了豐富的理論和臨床經(jīng)驗。補腎益智方是臨床治療AD的經(jīng)驗方，具有補腎填精、開竅益智的功效，本研究試通過該方對AD模型大鼠行為學的觀察，來探討其對AD模型大鼠學習記憶水平的影響，以期為臨床應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物 Wistar大鼠，18～20月齡，雄雌各半，分籠飼養(yǎng);自然照明。所有大鼠均由中山醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑、器材 腦立體定位儀(西安西北光電儀器廠)，Ibotenic acid(Sigma公司)，D-半乳糖 (上海試劑二廠)，補腎益智方(濃縮粉劑，6.44 g生藥/g成藥，廣東省中醫(yī)院制劑科，臨用前分別配制成17.6 g成藥/100 ml、8.8 g成藥/100 ml兩種濃度的液體)，石杉堿甲(上海紅旗制藥廠生產(chǎn)的雙益平片，臨用前配制成6 mg/100 ml液體)。

1.3 造模 造模大鼠給予腹腔注射以生理鹽水配制的0.96%D-半乳糖(上海試劑二廠)，劑量為5ml/kg體重，老年正常組(簡稱:正常組)腹腔注射等比例的生理鹽水，1次/d，連用6 w。第7周參照Paxins和watson大鼠腦立體定位圖譜中Meynert基底核定位，按坐標為前囟后1.4 mm，旁開2.4 mm，深7.3 mm的無名質(zhì)區(qū)定位，在麻醉后分別進行雙側(cè)無名質(zhì)區(qū)注射Ibotenic acid 1μl(生理鹽水配制，濃度為5μg/μl)造成AD模型。青年組和老年組在相同腦區(qū)注射等體積的生理鹽水，過程同前。術后青霉素連續(xù)治療3天，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 分組、給藥 術后1 w，將造模存活的大鼠隨機分為模型對照組(記為MC);補腎益智方高劑量組(記為HD，劑量相當于5.6 g生藥/kg體重);補腎益智方低劑量組(記為LD，劑量相當于2.8 g生藥/kg體重);石杉堿甲對照組(記為HU，相當于0.3 mg/kg體重);對照組為老年正常組(記為SC)，用藥劑量依據(jù)《藥理實驗方法學》第二版。

1.5 試驗項目 大鼠灌胃完第二天進行Morris水迷宮行為學檢測:(1)迷宮適應訓練和游泳能力檢驗:第一天，撤去平臺，選擇池壁一固定點，讓大鼠面向池壁入水，自由游泳2 min，并錄下其游泳軌跡。對明顯異常者予以剔除。(2)定向航行試驗:歷時5 d，從第二天起，每天分上、下午兩段，每段訓練4次，分別從南北(SW)、西北(NW)、東南(SE)和東北(NE)四個不同象限的池壁中點入水，每次大鼠游泳60 s，訓練時任意選擇一個入水點，測其在60s內(nèi)尋找到平臺所需的時間(逃避潛伏期)，如大鼠未能尋找到平臺，則將其引上平臺并記錄其逃避潛伏期為60 s。(3)空間探索試驗:用于測量大鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的能力。即在第7天時撤除水平臺，然后任選一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，測其在120 s內(nèi)在原象限的游泳時間及游泳距離占總距離的百分比。

1.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學檢測結(jié)果 各組5天總平均逃避潛伏期:SC組(40.54±22.05)s，LD 組(37.17±22.75)s，HD 組(47.85±18.93)s，HU 組(46.11±20.13)s，MC 組(51.54±15.75)s。原平臺象限游泳時間和游泳距離與總距離之比檢測結(jié)果，見表1。

2.2 各組每天平均逃避潛伏期組間比較 見表2。

2.3 各組原平臺象限以平臺中點為中心40 cm環(huán)穿環(huán)時間和次數(shù)的比較 見表3。

表1 原平臺象限游泳時間和游泳距離與總距離之比的百分數(shù)(x±s)

表2 各組每天平均逃避潛伏期比較(s，x±s)

表3 各組40 cm環(huán)穿環(huán)時間和次數(shù)比較(x±s)

3 討論

學習和記憶功能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的高級功能，其基本過程可分為三個階段，即獲得、鞏固和再現(xiàn)。Moris水迷宮主要用于學習記憶的神經(jīng)生物學機制探討和神經(jīng)藥理(包括中藥藥理)的研究。其中定位航行實驗用于考察動物的學習能力，空間搜索檢測其記憶能力。Morris能較全面地考察動物的認知過程，可排除尿液糞便等氣味對實驗結(jié)果的影響，客觀反映其認知水平。操作簡便，數(shù)據(jù)記錄準確，誤差小〔1〕。已經(jīng)廣泛用于學習記憶能力的測試，是目前此方面常用的實驗方法〔2〕。

認知功能方面的減退是AD病人的重要臨床表現(xiàn)。中醫(yī)認為AD的認知功能方面減退主要與老年衰憊、腎精失充有關。近來研究表明，補腎類中藥在延緩腦組織的衰老，提高神經(jīng)遞質(zhì)和其受體水平，改善學習記憶障礙等的能力方面有著獨特的優(yōu)勢〔3，4〕。

本文實驗結(jié)果顯示，該模型具有明顯的學習記憶功能障礙，中藥兩個劑量組的學習記憶能力均有一定的改善，中藥低劑量組改善更明顯，優(yōu)于石杉堿甲組中藥高劑量組與石杉堿甲組無明顯差異。

在原平臺象限游泳時間和距離與總值比值的百分數(shù)、40CM環(huán)穿環(huán)時間和次數(shù)檢測結(jié)果也顯示中藥低劑量組與模型組、石杉堿甲組比較具有明顯的優(yōu)勢，且多數(shù)指標較正常老年組為優(yōu)。而中藥高劑量組與模型組、石杉堿甲組比較，優(yōu)勢不明顯。Morris水迷宮檢測結(jié)果提示:補腎益智方對AD模型大鼠的學習記憶功能障礙有非常明顯的改善作用，效果優(yōu)于對照藥石杉堿甲。且補腎益智方改善作用的大小還與該藥的用藥劑量有很大的關系，其中的低劑量組的改善作用明顯優(yōu)于高劑量組，具體的量效關系尚待以后進一步的研究。

1 胡鏡清，溫澤淮，賴世隆，等.Morris水迷宮檢測的記憶屬性與方法學初探〔J〕．廣州中醫(yī)藥大學學報，2000;17(2):117-20.

2 Goldman-Rakic PS.Working memory and the mind〔J〕．Sci Am，1992;267:73-9.

3 宮 斌，莫啟忠，馬 駿，等.補腎中藥延緩老年小鼠腦功能衰老的機理研究〔J〕．中國老年學雜志，1996;16(3):170-2.

4 曹 娟，董聯(lián)玲，冀俊虎，等.紅景天對老年性癡呆大鼠行為學及海馬區(qū)凋亡相關蛋白表達的影響〔J〕．中國中醫(yī)急癥，2008;17(11):1567-9.