紅景天苷誘導小鼠肝癌細胞凋亡作用的機制

宋漢君 呂少春 李麗疆

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

紅景天苷具有調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗疲勞、抗抑郁等作用〔1～3〕。研究顯示，紅景天苷能抑制肝癌細胞(HepA)增殖，具有提高特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和非特異性殺傷細胞(NK)的活性〔4〕，但尚未進一步研究紅景天苷抗腫瘤作用機制。本試驗旨在分析紅景天苷誘導小鼠HepA肝癌細胞凋亡和作用機制，對腫瘤細胞凋亡抑制基因(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)進行測定，為紅景天苷的抗癌機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 蘇木精、伊紅購于北京中杉金橋生化試劑公司;DNA末端轉(zhuǎn)移酶缺口末端標記法(TUNEL)原位凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物技術有限公司;免疫組化試劑盒、濃縮對二氨基聯(lián)苯(DAB)顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司;兔抗鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體購于Santa Cruz生物公司;紅景天苷購于上海微晶生物試劑公司;環(huán)磷酰胺(CTX)購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;

1.1.2 試驗動物和細胞株 KM普通級小白鼠30只，雌雄各半，體重(20±2)g，購于佳木斯大學實驗動物中心，動物合格證號:SLXK(黑)20110001。分籠飼養(yǎng)，每籠10只，室溫(26±2)℃，均食用普通飼料，自由飲水，清潔級動物飼養(yǎng)房，光照8～10 h/d。HepA荷瘤種鼠，佳木斯大學細胞生物學實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠HepA肝癌模型 無菌條件下取傳代接種的種鼠HepA腹水瘤，以0.9%生理鹽水稀釋至5×106/ml，然后接種于實驗小鼠左腋下，0.3 ml/只。

1.2.2 試驗分組及藥物處理 試驗小鼠隨機分為三組，每組10只，24 h后，對照組給予生理鹽水灌胃0.2 ml/只，1次/d;CTX作為陽性藥物對照組(CTX組)，1次/d，25 mg/kg，腹腔注射;紅景天苷組(Sa組)每只小鼠腹腔注射紅景天苷溶液0.3 mg/d，連續(xù)注射 28 d。

1.2.3 觀察凋亡形態(tài)學變化 28 d后，脫頸處死各組小鼠，無菌迅速解剖出各組小鼠腫瘤組織，于甲醛中固定，酒精脫水，石蠟包埋，組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學變化。

1.2.4 TUNEL染色 石蠟切片脫蠟水合，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，加入蛋白酶K，PBS漂洗，浸入封閉液，PBS漂洗2次，標記反應。樣本用濾紙吸干，每個樣品滴加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)反應60 min，PBS漂洗3次，樣品用濾紙吸干。滴加辣根過氧化酶(HRP)工作液，反應30 min，滴加DAB工作液，顯色10 min，PBS漂洗3次，蘇木精復染，漂洗脫水，鏡下觀察。鏡下棕黃色顆粒即為凋亡細胞，而藍色細胞提示非凋亡細胞，計算陽性細胞百分數(shù)。選擇5個隨機視野，計算凋亡指數(shù)。

1.2.5 免疫組化檢測 Bcl-2、Bax應用免疫組化試劑盒對Bcl-2和Bax的表達進行檢測。鏡下棕黃色細胞為蛋白表達陽性的細胞，藍色細胞為陰性細胞，計算5個隨機視野陽性細胞百分數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用Origin7.5軟件進行分析，試驗數(shù)據(jù)以x±s表示，計量資料經(jīng)方差齊性檢驗為方差齊性，多組資料采用單因素方差分析，兩組間差異采用Duncan＇s檢驗。

2 結果

2.1 紅景天苷對腫瘤細胞凋亡形態(tài)學的影響 HE染色光鏡下顯示，對照組腫瘤細胞排列緊密，大小不一，形狀各異，胞核大且深染，具有明顯異型性。CTX組和Sa組細胞數(shù)目明顯減少，核染色質(zhì)聚于核膜邊緣，核型不規(guī)則，核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體，與對照組相比出現(xiàn)較多的凋亡細胞。見圖1。

2.2 TUNEL染色檢測細胞凋亡指數(shù) TUNEL染色光鏡下可見，對照組腫瘤細胞多染成藍色，即陰性細胞。而在CTX組和Sa組出現(xiàn)了更多的棕黃色顆粒。經(jīng)圖像分析，CTX組〔(8.89±0.88)%〕、Sa組〔(20.16±3.14)%〕與對照組 〔(4.88±0.62)%〕腫瘤細胞凋亡指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見圖2。

2.3 腫瘤細胞Bcl-2、Bax蛋白表達情況 CTX組和Sa組Bcl-2陽性表達顯著降低(41.91±7.46，27.47±5.23)，與對照組(69.50±8.36)差異顯著(P＜0.01)。而 Bax陽性表達經(jīng)過 CTX(43.52±7.45)和 Sa(52.78±9.06)處理后，與對照組(23.79±4.21)差異顯著(P＜0.01)。見圖3，圖4。

圖1 腫瘤細胞凋亡形態(tài)學變化(×400)

圖2 HepA肝癌細胞凋亡形態(tài)學變化(×200)

3 討論

通過紅景天苷誘導小鼠HepA肝癌細胞凋亡的上述系列試驗結果表明，紅景天苷能誘導小鼠腫瘤組織出現(xiàn)明顯的細胞凋亡形態(tài)學改變，增加腫瘤細胞凋亡數(shù)目，減少了Bcl-2增加Bax的表達，這表明紅景天苷抗小鼠HepA肝癌的作用與其誘導腫瘤細胞凋亡密切相關。

本實驗通過HE染色、TUNEL染色提示腫瘤細胞DNA大量斷裂，證明紅景天苷可誘導小鼠HepA肝癌細胞凋亡。細胞凋亡過程涉及多種基因的激活、表達與調(diào)控，如Bcl-2、半胱胺酸蛋白酶(caspase)、原癌基因(c-myc)、p53 等〔5，6〕。凋亡過程的紊亂與腫瘤等許多疾病的發(fā)生有直接或間接的聯(lián)系。許多化療藥物如紫杉醇、長春新堿等，能夠誘導腫瘤細胞凋亡，藥物誘導腫瘤細胞凋亡已成為抗腫瘤的一個重要策略。

線粒體凋亡途徑和細胞表面死亡受體介導的凋亡途徑是導致細胞程序性死亡的兩個主要途徑。而線粒體凋亡途徑被公認為一個主要的途徑，由Bcl-2家族蛋白介導(Bcl-2和Bax)，該蛋白在宮頸癌、肝癌、胃癌等腫瘤中出現(xiàn)高表達，本實驗結果推測，紅景天苷可通過啟動腫瘤細胞線粒體凋亡途徑引起細胞凋亡。

本試驗以小鼠為試驗對象，但是否可以在其他動物模型或人體中出現(xiàn)同樣的試驗結果目前還未曾可知，這是今后需要進一步研究的方向。

圖3 腫瘤組織Bcl-2蛋白的表達(×100)

圖4 腫瘤組織Bax蛋白的表達(×400)

1 Green DR，Evan GI.A matter of life and death〔J〕．Cancer Cell，2002;1(1):19-30.

2 Mlejnek P.Caspase inhibition and N6-benzyladenosine-induced apoptosis in HL-60 cells〔J〕．J Cell Biochem，2001;83(4):678-89.

3 Reed JC.Mechanisms of apoptosis〔J〕．Am JPathol，2000;157(5):1415-30.

4 Evan GI，Vousden KH.Proliferation，cell cycle and apoptosis in cancer〔J〕．Nature，2001;411(6835):342-8.

5 Takahashi A，Masuda A，Sun M，et al．Oxidative stress-induced apoptosis is associated with alterations in mitochondrial caspase activity and bcl-2-dependent alterations in mitochondrial pH〔J〕．Brain Res Bull，2004;62(6):497-504.

6 Muller PA，Vousden KH.p53 mutations in cancer〔J〕．Nat Cell Biol，2013;15(1):2-8.