人參皂苷Rg1對(duì)帕金森病小鼠黑質(zhì)EphB1、ephrinB2表達(dá)的影響

朱豐霞 王淑秀 段 瑛 李培艷 張哲瑩

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)致密區(qū)(SNc)多巴胺能神經(jīng)元變性及進(jìn)行性缺失〔1〕。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體(Eph)激酶是細(xì)胞表面型受體酪氨酸激酶(RTKs)的一種，其配體主要表達(dá)于細(xì)胞表面，被命名為ephrin。Eph/ephrin酪氨酸激酶家族可能參與調(diào)節(jié)PD多巴胺能神經(jīng)元的變性過程〔2〕。人參皂苷Rg1屬人參皂苷三醇型，具有保護(hù)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、防止細(xì)胞凋亡發(fā)生的功能〔3〕，對(duì)MPP+和氨基酸興奮性毒性對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷亦有保護(hù)作用〔4〕。人參皂苷Rg1可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡改善和治療PD〔5〕。本研究觀察人參皂苷Rg1對(duì)PD小鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中EphB1、ephrinB2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 12周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠27只，體重22～30 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證編號(hào)SCXK(京)2006-0009〕。自然光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2 試劑 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)購(gòu)于Sigma公司;人參皂苷Rg1購(gòu)于北京寰宇科技生物科技發(fā)展有限公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;SP免疫組化染色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司;TRizol(Cat.No.1559 6-026)為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品;酪氨酸羥化物(TH)和β-actin小鼠抗小鼠單克隆抗體為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品;EphB1兔抗小鼠多克隆抗體(H-80)、ephrinB2兔抗小鼠多克隆抗體(H-83)為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建 將27只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和人參皂苷Rg1組，每組9只。注射MPTP前，對(duì)照組和模型組腹腔注射0.9%生理鹽水(1 ml·kg-1·d-1)，人參皂苷Rg1組腹腔注射人參皂苷Rg1(10 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)3 d。預(yù)防給藥3 d后，對(duì)照組繼續(xù)腹腔注射0.9%生理鹽水(1 ml/kg)，模型組和人參皂苷 Rg1組腹腔注射 MPTP(20 mg/kg)，均注射4次，每次間隔2 h。在最后1次注射MPTP后第14天按不同實(shí)驗(yàn)要求取材。

1.4 游泳實(shí)驗(yàn) 分別于注射完MPTP后第1、5、9、13天將小鼠放入一個(gè)40 cm×25 cm×16 cm、水溫(27±2)℃的水箱中，觀察其游泳情況。小鼠游泳評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:后肢下沉頭漂浮者計(jì)0分;偶爾用后肢游動(dòng)并漂浮一邊者計(jì)10分;偶爾游泳者計(jì)15分;漂浮時(shí)間占整個(gè)受試時(shí)間一半者計(jì)20分;大部分時(shí)間游泳僅偶爾漂浮者計(jì)25分;連續(xù)不停游泳者計(jì)30分〔6〕。

1.5 免疫組化染色 小鼠經(jīng)6%水合氯醛麻醉(30 mg/kg)，4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定腦組織后，迅速開顱取腦，4%多聚甲醛4℃后固定過夜，置于20%蔗糖沉底后，轉(zhuǎn)入30%蔗糖至沉底，對(duì)包含黑質(zhì)的腦組織進(jìn)行冠狀冰凍連續(xù)切片，采用SP免疫組化方法染色。染色方法按照試劑說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照以PBS代替一抗進(jìn)行，余操作相同。每張切片隨機(jī)選取黑質(zhì)區(qū)的5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，取其平均值。

1.6 RT-PCR 應(yīng)用TRizol試劑提取組織中總RNA。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:94℃ 2 min，94℃ 30 s，55 ℃30 s，72℃ 1 min，共 30 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸5 min。GAPDH引物序列:正鏈為 5＇-GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3＇，負(fù)鏈為 5＇-AGTGTAGCCCAAGATGCC CTT-3＇，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為351 bp;EphB1引物序列:正鏈為5＇-CTGGCTATTACCGAGCTGACTT-3 ＇，負(fù) 鏈 為 5 ＇-CCCATAGGCTACTGATGGAGAC-3＇，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為279 bp;ephrinB2引物序列:正鏈為 5＇-GTGCCAGACAAGAGCCATGAA-3＇，負(fù)鏈為 5＇-GGTGCTAGAACCTGGATTTGG-3＇，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 169 bp。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈(310 nm波長(zhǎng))下觀察凝膠，采用快速凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜條帶，運(yùn)用Geentools分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以目的基因與GAPDH的積分光密度比值表示目的基因mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western印跡法 每100 mg組織中加入1 ml細(xì)胞裂解液與PMSF的混合液(100∶1)冰浴30 min;超聲1 s，間隔5 s，連續(xù)5次;4℃，12 000 r/min離心，17 min后取上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白定量后加1/4蛋白體積的5×SDS凝膠加樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，使蛋白變性，冰上冷卻。以12%SDS-PAGE電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉4℃冰箱封閉過夜后加入一抗(EphB1多克隆抗體，1∶150;ephrinB2 多克隆抗體，1∶150;β-actin單克隆抗體，1∶4 000)，4℃過夜。TBST沖洗后，分別與生物素標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG抗血清(1∶200)室溫震蕩孵育2 h。TBST洗滌后，化學(xué)發(fā)光法顯色，X線底片曝光。用HP掃描儀掃描實(shí)驗(yàn)的底片，用Image J圖像程序分析軟件分析免疫印跡蛋白條帶的積分光密度值，以目的基因與β-actin的積分光密度值之比值代表目的基因蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，采用 SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 游泳實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組相比，模型組小鼠游泳時(shí)肢體協(xié)調(diào)性較差，大多數(shù)小鼠在水中漂浮時(shí)間較長(zhǎng);人參皂苷Rg1組小鼠游泳情況較模型組有所改善，僅偶爾在水中漂浮。見表1。

2.2 免疫組化 對(duì)照組黑質(zhì)致密部可見大量TH陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)元，排列整齊呈條帶狀;與對(duì)照組相比，模型組TH陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少，排列相對(duì)混亂;人參皂苷Rg1組，TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較模型組增多。模型組小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(9.93±4.35)顯著低于對(duì)照組(20.80±7.08，P＜0.01)和人參皂苷 Rg1 組(13.27±7.11，P＜0.05)。

2.3 RT-PCR 模型組小鼠中腦黑質(zhì)EphB1 mRNA表達(dá)水平(0.71±0.01)顯著高于對(duì)照組(0.46±0.01，P＜0.01)和人參皂苷Rg1組(0.63±0.01，P＜0.01);模型組小鼠中腦黑質(zhì)ephrinB2 mRNA表達(dá)水平(0.50±0.06)顯著高于對(duì)照組(0.16±0.02，P＜0.01)和人參皂苷 Rg1 組(0.34±0.05，P＜0.01)，見圖1，圖2。

表1 小鼠游泳實(shí)驗(yàn)分值變化(x±s，n=9)

圖1 RT-PCR檢測(cè)小鼠黑質(zhì)EphB1 mRNA表達(dá)的變化

2.4 Western印跡法 模型組小鼠黑質(zhì)ephrinB2蛋白表達(dá)水平(0.40±0.02)顯著高于對(duì)照組(0.14±0.01，P＜0.01)和人參皂苷 Rg1 組(0.18±0.13，P＜0.01)，各組差異顯著(F=371.07，P＜0.01);模型組、對(duì)照組及人參皂苷Rg1組小鼠黑質(zhì)EphB1蛋白水平分別為 0.40±0.03、0.37±0.01、0.36±0.05，各組間EphB1蛋白表達(dá)水平無顯著差異。

圖2 RT-PCR檢測(cè)小鼠黑質(zhì)ephrinB2 mRNA表達(dá)的變化

3 討論

PD在65歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)1%，其主要病變是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元顯著變性丟失，黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能通路變性，紋狀體多巴胺遞質(zhì)濃度顯著降低，乙酰膽堿系統(tǒng)功能相對(duì)亢進(jìn)，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)減少、肌肉僵直、靜止性震顫等臨床表現(xiàn)〔7〕。

TH在多巴胺能神經(jīng)元中含量豐富，是腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志，由于黑質(zhì)區(qū)其他神經(jīng)元缺乏TH，故黑質(zhì)區(qū)TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元即多巴胺能神經(jīng)元。在PD患者腦組織中，TH表達(dá)含量明顯下降，表明多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少，因而黑質(zhì)中TH陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元數(shù)量減少已成為PD動(dòng)物模型建立成功的指標(biāo)之一〔8〕。MPTP能顯著降低黑質(zhì)中TH的表達(dá)水平〔8〕。本研究結(jié)果提示MPTP誘導(dǎo)了黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性，而人參皂苷Rg1可能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受MPTP的毒性作用或防止多巴胺能神經(jīng)元凋亡。游泳實(shí)驗(yàn)顯示模型組小鼠四肢協(xié)調(diào)性比對(duì)照組和人參皂苷Rg1組差，可能與MPTP致多巴胺能神經(jīng)元變性壞死或凋亡有關(guān)〔9〕，提示人參皂苷Rg1對(duì)神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用。

Eph受體酪氨酸激酶是一類具有酪氨酸激酶活性，參與細(xì)胞生理和病理過程的受體樣物質(zhì)。Eph受體及其配體ephrinB2在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中參與組織邊界形成、細(xì)胞遷移、軸突向?qū)А⑼挥|信息和神經(jīng)環(huán)路集合〔10〕。EphB在正常成年大鼠神經(jīng)系統(tǒng)中低表達(dá)〔11〕，當(dāng)神經(jīng)損傷后其表達(dá)上調(diào)〔12〕，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，EphB在這些細(xì)胞上重新分布〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)EphB1和ephrinB2在正常小鼠和PD小鼠黑質(zhì)中均有不同程度的表達(dá)，PD模型中EphB1和ephrinB2的 mRNA及 ephrinB2的蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，可能由于大劑量注射MPTP后導(dǎo)致小鼠黑質(zhì)大量的多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，局部小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，且EphB1和ephrinB2在這些細(xì)胞中重新分布呈高表達(dá)有關(guān)〔13〕，而EphB1蛋白在各組的表達(dá)無顯著性差異，可能由于刺激因子尚未影響其翻譯過程。人參皂苷Rg1干預(yù)后EphB1、ephrinB2的表達(dá)較模型組明顯減少，可能與人參皂苷Rg1具有抗炎作用〔14〕，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增生有關(guān)。

綜上所述，本研究認(rèn)為人參皂苷Rg1可能通過降低EphB1、ephrinB2的表達(dá)改善PD癥狀，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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