煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶1基因?qū)w外原代培養(yǎng)神經(jīng)元軸突發(fā)育的影響

趙 虹 張驚宇 車守梅 赫丹丹 郭朝暉

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬四院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150001)

目前如何預防和治療神經(jīng)退行性疾病已成為亟待解決的問題。神經(jīng)元缺失、軸突變性是多種神經(jīng)退行性疾病的一個重要特征。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶NMNAT是一類功能尚不完全明確的酶類，該類蛋白質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達。NMNAT1催化NAD的合成〔1，2〕。NAD在所有活細胞的新陳代謝中起關鍵作用，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為輔酶參與大量轉(zhuǎn)移反應〔3〕，NMNAT1在NAD合成途徑中是主要酶〔4〕，軸突變性被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的新的治療靶點，而且沃勒變性是軸突變性的自我損傷過程，往往發(fā)生在軸突損傷或神經(jīng)元變性時，例如帕金森病(PD)或阿爾茨海默病(AD)〔5～7〕，沃勒變性的軸突由 NMNAT1促使 NAD 的合成得到保護〔8〕，已有研究表明在果蠅中過表達NMNAT1基因卻能夠顯著抑制和延緩軸突的退化〔9〕。

1 材料與方法

1.1 動物和藥物 原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元來源于ICR小鼠(SLAC.CHINA)的胚胎，動物實驗保護協(xié)議由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院動物倫理委員會批準。煙酰胺轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶抑制劑FK-866購置于美國Cayman化學制品公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA構(gòu)建 編碼小鼠NMNAT1基因的cDNA從小鼠腦cDNA庫中經(jīng)PCR擴增得到的，所用引物:5'-ATGGACTCATCCAAGAAGACAGA-3'和5-TCACAGAGTGGAGTGGAATGGTTGTGCTTG-3'，并克隆到 PIRES2-EGFP載體(Invitrogen公司)中產(chǎn)生野生型過表達NMNAT1(NMNAT1-OE)序列。

1.2.2 shRNA plasmids的生成 專門針對小鼠NMNAT1 mRNA三個非重疊序列設計后構(gòu)建到H1啟動子RNAi載體上(psuper，Oligoengine，USA)。最有效的 19-核苷酸靶序列是 5'-ACGAGTGGATCACCAATGA-3'(KD-shRNA)。非特異性對照寡核苷酸設立為無關序列作為對照，該序列為:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'(Scr-shRNA)，含干擾序列的寡核苷酸在DNA合成過程中，末端引入BgLⅡ和XhoⅠ酶切位點。所有序列均被測序證實正確。

1.2.3 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 原代新皮層神經(jīng)元來源于剛出生小鼠(PO小鼠)的胚胎，簡而言之，分離新皮層組織，在4℃含6%葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中清洗2次，然后0.3%胰蛋白酶中37℃消化10 min，并且在補充了B27添加劑 (Invitrogen)0.5 mmol/L左旋谷氨酸和20 mmol/L HEPES的無血清培養(yǎng)基中輕輕磨碎分離，pH7.4在體外培養(yǎng)3～6 d后，神經(jīng)元用于形態(tài)學實驗研究。培養(yǎng)的神經(jīng)元通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染。簡單地說，一個包含質(zhì)粒，電穿孔緩沖物和神經(jīng)元的混合物移到一個容器中，用轉(zhuǎn)染試劑盒通過電穿孔技術轉(zhuǎn)染。

1.2.4 免疫印記分析 神經(jīng)元溶解在細胞溶解緩沖液中，(10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、140 mmol/L NaCl、0.2%聚乙二醇辛基苯基醚)，包含蛋白酶抑制劑的混合物中1 h，離心10 min，以合適的SDS-PAGE膠進行蛋白電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF(Millipore)膜上，用封閉液稀釋一抗，將已封閉的膜置于一抗溶液中4℃過夜，然后放入用辣根過氧化物酶標記的二抗中孵化(1∶5 000;Jackson Immuno Research)，細胞膜用熒光檢測試劑(GE，USA)檢測，小鼠的單克隆抗體和小鼠的抗β-actin抗體分別來自于Santa cruz(sc-30842)和Chemicon(MAB1501)。

1.2.5 免疫細胞化學 細胞固定于含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS緩沖液中，用5%BSA和0.2%Triton-100在PBS緩沖液中封閉和透化后，細胞在一抗中4℃孵化一夜，然后細胞用Alexa488和Alexa568共軛二抗在室溫下清洗孵化1 h。小鼠單克隆抗-Taul(MAB2239)和小鼠單克隆抗體Map2(AB5622)購置于Chemicon。

1.2.6 成像和圖像分析 膠片在熒光顯微鏡下掃描(尼康，日本)，分析神經(jīng)突的延長和分支，關鍵是能夠成像一個單一神經(jīng)元的全部過程，并能區(qū)別它們是軸突還是樹突，對成像軸突，需要使用相對低功率放大(20×)獲得圖像，包括神經(jīng)元的成像。被轉(zhuǎn)染的細胞用綠色熒光GFP和軸突特異性標記Tau-免疫雙標神經(jīng)元軸突。Neurolucida軟件用來分析軸突的生長，并且計算軸突的長度。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用prism5.0軟件進行單因素方差分析以及 post-hoct-test。

圖1 在原代培養(yǎng)神經(jīng)元中NMNAT1基因的RNA干擾與過表達

圖2 在培養(yǎng)神經(jīng)元中NMNAT1對軸突形態(tài)的影響

2 結(jié)果

2.1 小鼠NMNAT1 shRNA和過表達載體在培養(yǎng)的神經(jīng)元中有效構(gòu)建 為了研究NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能，設計了一個短發(fā)卡RNA(shRNA)的針對小鼠NMNAT1 mRNA的shRNA結(jié)構(gòu)(NMNAT1KD-shRNA)，設計了無針對性對照的shRNA(NMNAT1Scr-shRNA)，把每個shRNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，檢驗敲除內(nèi)源性NMNAT1蛋白的能力，Western印跡分析顯示NMNAT1-OE高表達NMNAT1(6.31±0.24)而KD-shRNA有效敲除了 NMNAT1基因(0.21±0.13，圖1)，而 ScrshRNA沒有影響到NMNAT1表達(1.71±0.21)。這些結(jié)果證明小鼠NMNAT1過表達和干擾慢病毒載體構(gòu)建在原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)元中是有效的。

2.2 NMNAT1對培養(yǎng)鼠神經(jīng)元軸突形態(tài)的調(diào)節(jié) 如圖2所示，用NMNAT1-OE或KD-shRNA病毒載體轉(zhuǎn)染了DIV0神經(jīng)元，并用GFP和軸突特異標志Tau1免疫雙標DIV0神經(jīng)元。過表達和敲除NMNAT1在軸突的總長度和分支上顯示出顯著的作用(圖2)，上調(diào)NMNAT1促進軸突的生長和分支，而下調(diào)NMNAT1則有相反的作用，沒有影響神經(jīng)元的極性。添加2 nmol/L FK-866在體外也阻滯了軸突的生長，這和下調(diào)NMNAT1的數(shù)據(jù)一致，結(jié)果顯示在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中操縱NMNAT1的表達對軸突的生長有重要作用。見表1。

表1 在培養(yǎng)神經(jīng)元中NMNAT1對軸突形態(tài)的影響(x±s)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染了Scr-shRNA的神經(jīng)元比較，敲除了NMNAT1的shRNA引起了軸突分支的顯著減少以及總長度的減少。而且過表達NMNAT1促進了軸突的生長，這與過去報道的培養(yǎng)的脊髓背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元相一致〔7〕。軸突在神經(jīng)元聯(lián)絡時發(fā)揮了至關重要的作用，改變軸突結(jié)構(gòu)可能會影響信息的傳播過程，如學習和記憶〔10，11〕。本研究結(jié)果表明 NMNAT1這個神經(jīng)退行性疾病的相關蛋白在大腦中高水平表達，在體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元中參與促進軸突生長和復雜度的形態(tài)變化，提示NMNAT1在神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)退行性疾病中的一個重要作用。

一項在果蠅的研究表明NMNAT1是作為一個伴護蛋白而起作用〔11，12〕，關于華勒氏變性的幾項研究顯示 NMNAT1的NAD 合成活動需要它對軸突的保護作用〔11，13～16〕，然而對于中樞神經(jīng)元，尤其是神經(jīng)元經(jīng)歷變性的過程時NMNAT1是否作為一個保護蛋白或酶而發(fā)揮功能知道的很少。因此，在不同的變性過程中，NMNAT1的不同功能特征將幫助理解它在神經(jīng)退行性疾病中的作用。本研究結(jié)論是第1次展示了NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突中所起的作用，已經(jīng)為研究人員開發(fā)了一實驗性的實驗，在原代培養(yǎng)神經(jīng)元中通過檢測軸突形態(tài)去研究不同刺激下NMNAT1的保護作用。

綜上所述，本實驗闡明了NMNAT1基因的表達水平與神經(jīng)退行性疾病造成神經(jīng)元缺失的潛在關系，將為進一步尋找可能的神經(jīng)退行性疾病的潛在藥物靶點奠定基礎。

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