VEGF-C及其受體VEGFR-3和D2-40在老年喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義

葉成剛 李偉利

(湖北江漢油田總醫(yī)院，湖北 潛江 433124)

喉癌的發(fā)病特點(diǎn)為高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、晚期比例高以及治療耐受力差〔1〕。研究表明，淋巴管生成在惡性淋巴侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到重要的作用。有研究報(bào)道，血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)及其受體(VEGFR-3)可能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成影響血管、淋巴管生成，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔2〕。本研究通過免疫組化方法檢測喉癌組織、癌旁組織標(biāo)本中VEGF-C、VEGFR-3的表達(dá)，旨在探討其表達(dá)水平與老年喉癌臨床特征的關(guān)系，為喉癌發(fā)病機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月至2014年6月在我院手術(shù)切除的老年喉癌組織、癌旁組織(距離腫瘤切緣＞0.5 cm)標(biāo)本68例，均經(jīng)病理診斷證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，癌旁組織經(jīng)病理證實(shí)為炎癥和正常組織，患者術(shù)前均未行放療和化療;選擇同期我院接受手術(shù)治療30例患者正常喉黏膜組織標(biāo)本作為對照，術(shù)后病理診斷為正常組織。老年喉癌患者中，男35例，女33例;年齡66～79〔平均(71.1±7.6)〕歲;吸煙量＞400 支/年患者 44例，≤400支/年患者24例;癌腫＞3 cm患者44例，癌腫≤3 cm患者24例;病理學(xué)分級:G1級17例，G2級23例，G3級28例;喉癌分型:跨聲門型10例，聲門上型32例，聲門型26例;TNM分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期14例，Ⅲ期22例，Ⅳ期23例;淋巴轉(zhuǎn)移組40例，無淋巴轉(zhuǎn)移28例。正常對照組男16例，女14例;年齡65 ～78〔平均(70.3±6.9)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測 應(yīng)用鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶免疫組織化學(xué)染色法，所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋，按常規(guī)4μm制成連續(xù)的切片，用二甲苯脫去蠟、梯度乙醇脫水。用新鮮配置的3%甲醇過氧化氫處理;VEGF-C、VEGFR-3采用枸櫞酸緩沖液修復(fù)抗原;D2-40使用Tris-EDTA緩沖工作液修復(fù)抗原。均加一抗(稀釋濃度 VEGF-C、VEGFR-3為1∶100，D2-40為1∶50)，加入山羊血清在 4℃下孵育過夜;加入PBS緩沖液沖洗，加二抗10 min、三抗10 min，PBS緩沖液沖洗，流水沖洗，DAB顯色、加入蘇木素復(fù)染，梯度乙醇水化、加入二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果判定 VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)由兩位病理科醫(yī)師在未知臨床資料的情況下判定，以細(xì)胞黃色顆粒為陽性細(xì)胞。按照Fromowitz等的合計(jì)分法〔3〕，將陽性著色細(xì)胞所占百分比與細(xì)胞著色強(qiáng)度兩者結(jié)合判定，得出陽性率，包括:(1)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為5個(gè)視野中陽性細(xì)胞的平均數(shù)占視野中細(xì)胞數(shù)的比例，陽性細(xì)胞率≤25%計(jì)0分，26% ～50%計(jì)1分，51% ～70%計(jì)2分，＞70%計(jì)3分;(2)按多數(shù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度計(jì)分:無色計(jì)0分，多數(shù)陽性細(xì)胞呈淺棕黃計(jì)1分，多數(shù)陽性細(xì)胞呈棕黃計(jì)2分，多數(shù)陽性細(xì)胞呈棕褐計(jì)3分，將以上兩項(xiàng)積分相加:0分為陰性，＞0分為陽性，并計(jì)算陽性百分率。

D2-40陽性淋巴管判斷標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)數(shù)方法:參照Weidner方法進(jìn)行微淋巴管計(jì)數(shù)，在高倍鏡(400倍)下對淋巴管進(jìn)行計(jì)數(shù)，每份計(jì)數(shù) 4個(gè)視野，取其平均值為LVD(D2-40陽性脈管數(shù)/HP)〔4〕。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用x±s表示，進(jìn)行Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)。應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織、癌旁組織及正常喉組織中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表達(dá) VEGF-C、VEGFR-3在喉癌組織、癌旁組織及正常喉組織中均有表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。其中，VEGF-C與VEGFR-3在喉癌組織標(biāo)本中的陽性表達(dá)率(73.5%，72.1%)顯著高于癌旁組織(25.0%，27.9%)和正常喉黏膜組織(3.3%，3.3%)(均P＜0.01)，見表1。D2-40在喉癌組織中的表達(dá)為(8.164±3.261)，顯著高于癌旁組織(2.186±0.452)和正常喉組織(2.677±0.197)(P＜0.05)。

2.2 喉癌組織中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表達(dá)與臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分型有關(guān)(均P＜0.05)，與病理分級、吸煙史、腫瘤的大小和性別無關(guān)(P＞0.05)。

2.3 喉癌組織中 VEGF-C、VEGFR-3和 LVD的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析顯示VEGF-C與VEGFR-3兩者表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.899，P＜0.01)。

表1 喉癌組織、癌旁組織及正常喉組織中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表達(dá)情況比較〔n(%)〕

表2 喉癌組織中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

VEGF-C是由Joukov等用親和層析法分離得到的與肝素結(jié)合的生長因子，與VEGF-A具有高度同源性，是近年來研究的熱點(diǎn)之一。VEGF-C可以促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，從而起到促進(jìn)新血管形成的作用，在這一過程中血管通透性明顯增強(qiáng)〔5〕。VEGFR-3是酪氨酸蛋白激酶家族受體，屬于VEGF-C特異性受體，主要位于淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞，臨床研究〔6〕發(fā)現(xiàn)，VEGF-C在多種腫瘤組織中比正常組織表達(dá)高，在選擇的35個(gè)腫瘤標(biāo)本中共檢測到19個(gè)標(biāo)本具有VEGF-C mRNA的表達(dá)。D2-40是一種淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，可以特異地與癌胚抗原M2A結(jié)合，當(dāng)前作為新生淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物特異性最高〔7〕。

研究結(jié)果提示，VEGF-C和VEGFR-3的表達(dá)與喉癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。惡性腫瘤中VEGF-C表達(dá)的升高并導(dǎo)致淋巴轉(zhuǎn)移是由于惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后快速產(chǎn)生磷酸化，誘導(dǎo)胞質(zhì)內(nèi)信號的傳導(dǎo)，進(jìn)而使DNA有絲分裂旺盛，引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生從而導(dǎo)致淋巴管增生，使淋巴管的通透性增高，增大腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的可能性〔7，8〕。

本研究提示D2-40可能參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展。在乳腺癌、胃癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中證實(shí)LVD可以作為腫瘤淋巴管生成的重要指標(biāo)，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C及其受體VEGFR-3在癌組織中的高表達(dá)與LVD及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性〔9，10〕。正常情況下，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞為靜止?fàn)顟B(tài)，而在外傷、炎癥或者腫瘤情況下，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞會遷移至局部組織并在生長因子作用下形成淋巴管〔11〕。癌細(xì)胞侵入到淋巴管被認(rèn)為是基于增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲性或是癌細(xì)胞產(chǎn)生消化酶對其基質(zhì)破壞，產(chǎn)生的VEGF-C可以引起周圍淋巴管增生與擴(kuò)張，同時(shí)癌細(xì)胞也很容易侵入淋巴管，通過侵襲腫瘤病灶周邊原有的淋巴管系統(tǒng)進(jìn)入淋巴液進(jìn)而形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔12〕。

此外，VEGF-C可能通過多條通路激活淋巴上皮細(xì)胞內(nèi)膜上的受體引起腫瘤細(xì)胞淋巴管的增生。此外，筆者認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞可能通過旁分泌途徑分泌VEGF-C并與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上相關(guān)受體結(jié)合，從而使VEGFR-3酪氨酸酶產(chǎn)生磷酸化，導(dǎo)致腫瘤周圍淋巴管生成和擴(kuò)張，增加腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的可能性〔13〕。而通過深入研究D2-40，并通過阻斷VEGF-C和VEGFR-3信號傳導(dǎo)通路表達(dá)，有望成為阻斷癌細(xì)胞經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移的重要手段之一。

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