組織蛋白酶B、基質(zhì)金屬蛋白酶-2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

薛興陽 孟 江 周 明 趙光日 傅文凡 楊嶸皓 趙 健

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，廣東 廣州 510095)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)治療失敗和死亡的主要原因是瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤侵襲。組織蛋白酶B(CB)是一種細(xì)胞溶酶體含巰基蛋白酶，主要與細(xì)胞外基質(zhì)中層黏連蛋白的分解有關(guān)，層黏連蛋白是細(xì)胞基質(zhì)間相互作用和與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)的基底膜的主要成分，另外，它還可降解纖維連接蛋白、Ⅳ 型膠原等〔1〕?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是不僅可以降解基底膜和基質(zhì)、突破基質(zhì)屏障、促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，而且還可通過毛細(xì)血管內(nèi)生成及新生血管生成等方式促進(jìn)腫瘤生長和擴(kuò)散〔2〕。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測NSCLC組織中CB和MMP-2蛋白的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2004年1月至2005年12月在我院行NSCLC術(shù)后存檔的蠟塊，共75例，男53例，女22例，年齡33～76(平均58.1)歲，鱗癌33例，腺癌42例。患者術(shù)前均未經(jīng)任何治療。同時(shí)選取病理證實(shí)為28例良性肺病變標(biāo)本為對照。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①術(shù)前未經(jīng)任何化療或放射治療。②進(jìn)行根治性手術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為NSCLC，組織學(xué)分類明確的肺癌患者。③術(shù)后石蠟標(biāo)本保存完好，有足夠待測組織標(biāo)本者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①術(shù)前作過放、化療及不能行根治手術(shù)者。②術(shù)后病理診斷組織學(xué)分類不明確者。③術(shù)后石蠟標(biāo)本保存不完整者。

1.4 主要試劑 CB兔單克隆抗體購自美國Epitomics公司，MMP-2鼠單克隆抗體購自德國Leica公司。

1.5 方法

1.5.1 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)采用S-P法進(jìn)行。具體步驟:脫蠟，水化組織切片，3%H2O2孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;抗原修復(fù)后分別滴加一抗，室溫37℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3 次;滴加雙抗室溫孵育 20 min，PBS沖洗，5 min×3次;應(yīng)用DAB顯色劑顯色;自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。本實(shí)驗(yàn)中所有標(biāo)本的檢測均由同一病理技師完成，并在顯微鏡下顯色觀察，嚴(yán)格質(zhì)控。實(shí)驗(yàn)中設(shè)用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5.2 染色判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞質(zhì)染色為淡黃至棕黃色者為陽性細(xì)胞;每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，得出陽性細(xì)胞百分比;陽性細(xì)胞＜10%為0分，10% ～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分。按評分高低分級:0～1分定義為陰性表達(dá)，2分或以上為陽性表達(dá)。以上結(jié)果由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片并記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CB和MMP-2在NSCLC及肺良性病變組織中表達(dá) CB和MMP-2在NSCLC中表達(dá)的陽性率(43/75，48/75)明顯高于良性肺病變(7/28，4/28

2.2 CB和MMP-2的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系如表1所示，低分化和中-高分化肺癌組織中的CB和MMP-2陽性表達(dá)水平無顯著性差異(P＞0.05);MMP-2表達(dá)的陽性率與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 CB和MMP-2的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NSCLC中CB和MMP-2表達(dá)水平間的相關(guān)性 CB和MMP-2表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.308，P=0.007)。

3 討論

NSCLC是指除小細(xì)胞癌以外的其他所有類型的肺癌，主要包括腺癌和鱗癌，是肺癌最常見的病理類型，約占所有肺癌患者的 80% ～85%〔3〕。

CB屬于半胱氨酸蛋白酶家族，是細(xì)胞溶酶體中的一種半胱氨酸蛋白酶，為一肽鏈外切酶。在溶酶體的酸性環(huán)境中，其活性位點(diǎn)呈閉合環(huán)狀態(tài)。當(dāng)pH值升高時(shí)，閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開，從而成為肽鏈內(nèi)切酶，在溶酶體降解蛋白質(zhì)途徑中發(fā)揮著必不可少的作用。Kayser等〔4〕報(bào)道肺癌組織CB表達(dá)與肺癌患者病情發(fā)展、肺癌細(xì)胞分化程度相關(guān)及與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。另有研究證實(shí)，下調(diào)或沉默CB在惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力則大大減弱〔5〕。CB能夠直接降解或激活纖溶酶原激活劑及基質(zhì)金屬蛋白酶等而間接降解細(xì)胞外基質(zhì)成分〔6〕。近來很多研究在體外實(shí)驗(yàn)通過反義或RNA干擾技術(shù)聯(lián)合沉默CB及其他蛋白酶類，取得明顯抑制腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移的作用〔7〕。本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道不完全符合，可能是的樣本量少。

其中MMP-2由于能夠特異地降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，而被認(rèn)為是在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中最直接和最重要的基質(zhì)金屬蛋白酶〔8〕。Passlick等〔9〕的前瞻性研究揭示，在早期階段的NSCLC中MMP-2過度表達(dá)預(yù)示不良的后果在NSCLC中高表達(dá)的MMP-2是肺癌好的腫瘤標(biāo)記物。Thomas等〔8〕報(bào)道MMP-2在NSCLC表達(dá)率為41%，與肺癌的組織學(xué)類型、TNM分期無關(guān)，而與其分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。呂志強(qiáng)等〔10〕用免疫組織化學(xué)法檢測42例肺癌組織中MMP-2蛋白的表達(dá)和微血管密度，結(jié)果顯示肺癌組織中MMP-2蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，MMP-2高表達(dá)者的預(yù)后較差，且MMP-2與腫瘤血管形成有密切關(guān)系。Wang等〔11〕對現(xiàn)有非小細(xì)胞肺癌文章meta分析研究表明MMP-9高表達(dá)提示預(yù)后更差。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MMP-2在NSCLC中表達(dá)高于肺良性病變，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC的原發(fā)病灶MMP-2表達(dá)和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MMP-2和CB參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者的預(yù)后密切相關(guān)提示CB可能對預(yù)后評估有一定價(jià)值?？傊?，MMP-2和CB在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào)，二者可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，對活檢組織進(jìn)行二者的聯(lián)合檢測，可能有助于預(yù)后的判斷。

1 李美寧，程牛亮.組織蛋白酶B與腫瘤〔J〕．國外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊，2005;32(6):429-32.

2 Jones JL，Walker RA.Control of matrix metalloproteinase activity in cancer〔J〕．J Pathol，1997;183(4):377-9.

3 Finger EC，Turley RS，Dong M，et al．T beta RIII suppresses non-small cell lung cancer invasiveness and tumorigenicity〔J〕．Carcinogenesis，2008;29(3):528-35.

4 Kayser K，Richter N，Hufnagl P，et al．Expression，proliferation activity and clinical significance of cathepsin B and cathepsin L in operated lung cancer〔J〕．Anti Cancer Res，2003;23(3C):2767-72.

5 Gondi CS，Lakka SS，Yanamandra N，et al．Adenovirus-mediated expression of antisense urokinase plasminogen activator receptor and antisense cathepsin B inhibits tumor growth，invasion，and angiogenesis in gliomas〔J〕．Cancer Res，2004;64(12):4069-77.

6 Buck MR，Karustis DG，Day NA，et al．Degradation of extracellular marix proteins by human cathepsin B from normal and tumoral tissues〔J〕．Biochem J，1992;282(2):273-8.

7 Lakka SS，Gondi CS，Yanamandra N，et al．Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion，tumor growth and angiogenesis〔J〕．Oncogene，2004;23(27):4681-9.

8 Thomas P，Khokha R，Shepherd FA，et al．Differential expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in non-small cell lung cancer〔J〕．J Pathol，2000;190(2):150-6.

9 Passlick B，Sienel W，Seen-Hibler R，et al．Overexpression of matrix metalloproteinase 2 predicts unfavorable outcome in early-stage non-small cell lung cancer〔J〕．Clin Cancer Res，2000;6(10):3944-8.

10 呂志強(qiáng)，李海剛，謝德榮，等.肺癌組織中MMP-2表達(dá)及與腫瘤血管形成關(guān)系〔J〕．中國腫瘤，2004;13(6):378-80.

11 Wang J，Cai Y.Matrix metalloproteinase 2 polymorphisms and expression in lung cancer:a meta-analysis〔J〕．Tumour Biol，2012;33(6):1819-28.