iTRAQ技術在真菌研究中的應用進展

劉原志 章強強

(復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室，上海200040)

同位素標記相對和絕對定量技術 (isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)是美國應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)在2004年推出的一項功能強大的多肽體外同位素標記技術［1］。該技術采用4種或8種同位素編碼的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團及串聯(lián)質譜分析，可以同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對水平。自2004年推出以來，該技術已被應用于細菌、真菌、人體組織及體液等多種樣本的蛋白質鑒定和定量，在信號轉導及翻譯后修飾研究、基因與蛋白質表達相關分析和細胞膜與亞細胞結構分析等生命科學領域的應用也得到了廣泛關注。在iTRAQ四標試劑基礎上，2007年ABI公司又推出了iTRAQ八標試劑，進一步增加了檢測樣本的通量［2］。

真菌的致病作用是多種蛋白質共同參與下的真菌-宿主相互作用的復雜過程，因此整體、定量地分析真菌致病過程中的差異表達蛋白質譜，對于研究真菌的致病機制具有重要作用。包括iTRAQ技術在內的比較蛋白質組學方法著重于篩選不同樣本之間的差異蛋白質譜，揭示細胞在生理及病理不同狀態(tài)下的生物進程變化，獲得對某些關鍵蛋白質的定性、定量和功能信息［3］，在真菌致病性及疾病早期診斷等方面具有重要的應用價值。本文對iTRAQ技術在真菌研究中的應用進展作一綜述。

1 iTRAQ技術介紹

1.1 iTRAQ技術基本原理

iTRAQ技術是一種新的、功能強大的可以同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質相對含量或絕對含量的方法，這種方法是建立在iTRAQ試劑基礎上的［4］。iTRAQ試劑是一種小分子同重元素(isobaric)化學物質，它包括三個部分:一端為報告基團(reporter group)，中間為平衡基團 (balance group)，另一端為肽反應基團 (peptide reactive group)。iTRAQ四標試劑是由4種相對分子質量分別為114、115、116和117的報告基團，相對分子質量分別為31、30、29和28的平衡基團及一個相同的肽反應基團組成。不同的報告基團分別與相應的平衡基團相配后，相對分子質量均為145，即等量異位標簽。而iTRAQ八標試劑是由8種相對分子質量均為305的等量異位標簽分子組成，標簽分子由相對分子質量分別為 113、114、115、116、117、118、119和121的報告基團，相對分子質量為192、191、190、189、188、187、186 和 184 的平衡基團，以及一個相同的氨基酸特異性多肽反應基團組成［5］，由于苯丙氨酸的質荷比為120，為了避免對質譜鑒定結果造成干擾，八標試劑中的報告基團中缺少120。

肽反應基團將iTRAQ標簽與肽段的N-端基團和每個賴氨酸側鏈相連，可以標記所有的酶解肽段。平衡基團保證iTRAQ標記的同一肽段的質荷比相同，因此無論哪一種iTRAQ試劑標記樣本，在第一級質譜檢測中，不同樣本中的相同蛋白質表現(xiàn)為同一質荷比。用串聯(lián)質譜方法對第一級質譜檢測到的前體離子 (Precursor ion)進行碰撞誘導解離，產(chǎn)物離子通過二級質譜進行分析。在二級質譜過程中，標記多肽分解為報告基團、平衡基團及氨基酸。報告基團在MS/MS圖上表現(xiàn)為診斷離子(Diagnostic ion)，為iTRAQ技術蛋白質定量的關鍵，其峰高和面積代表了不同樣本中同一蛋白質的相對豐度。同時多肽的酰胺鍵斷裂，形成一系列y-離子和b-離子，通過查詢數(shù)據(jù)庫可以鑒定出相應的蛋白質前體。

1.2 iTRAQ技術操作流程

以兩個樣本為例，iTRAQ技術大致流程如圖1所示，樣品經(jīng)過還原烷基化、胰蛋白酶酶解得到肽段。將肽段用iTRAQ試劑標記，再將標記樣本混合，最后用LC-MS/MS進行分析。每一個iTRAQ實驗可得到數(shù)千個可識別的多肽和上百個可鑒定的蛋白質。因此，生物信息學的工具和方法對于分析這些數(shù)據(jù)必不可少。iTRAQ制造商提供的軟件如Pro Quant、Protein Pilot等可用于分析這些蛋白質組學數(shù)據(jù)［6］。其他軟件如 Shadforth［7］開發(fā)的 i-Tracker等也可用于數(shù)據(jù)分析及解釋。

圖1 iTRAQ技術操作流程Fig.1 Overview of iTRAQ reagents methodology

1.3 iTRAQ技術的優(yōu)缺點

目前，蛋白質組學研究中應用比較成熟的定量方法主要有兩種:一種基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色，另一種基于質譜檢測技術［8］。目前應用比較廣泛的雙向電泳技術主要是雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE)。與傳統(tǒng)雙向電泳技術相比，2D-DIGE雖然準確性和重復性更高，但仍不能克服雙向電泳本身的缺陷，如:操作繁瑣;難以與質譜直接聯(lián)用，自動化程度低;對于低豐度蛋白、極大蛋白(相對分子質量＞200 kD)、極小蛋白 (相對分子質量＜8 kD)、極堿性蛋白和疏水性蛋白等難以進行有效分離，限制了其應用范圍。

基于質譜的蛋白質組學定量技術可以分為標記定量技術和非標記定量技術兩大類。標記定量技術可通過使用代謝標記、同位素編碼親和標簽(isotope-coded affinity tags，ICAT)和在培養(yǎng)過程中使用穩(wěn)定性同位素標記的氨基酸(stable isotope labeling of amino acids in culture，SILAC)等來區(qū)別兩種不同樣品的蛋白質，再通過質譜進行分析比較。其中ICAT技術目前已得到較廣泛的應用，可以精確的分析兩種不同樣品蛋白質表達的差異。其缺陷為:依賴親和素色譜柱可能由于低色譜容量導致樣品損失或不可逆的非特異性結合造成樣品污染;只能標記含有半胱氨酸殘端的蛋白質，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白質將被遺失［9］。

iTRAQ技術作為一種新的蛋白質定量技術，比較于傳統(tǒng)技術，其優(yōu)點為:①由于iTRAQ試劑可以與肽段的N-端基團和賴氨酸側鏈相連，因此幾乎樣本中的所有蛋白質均可被標記，包括雙向電泳技術不能檢測的蛋白質，如膜蛋白、疏水蛋白等以及ICAT技術不能標記的含有半胱氨酸的蛋白質［10］。由于每種蛋白質有更多的肽段可被分析，提高了蛋白質鑒定的覆蓋率和可信度。②可以同時對多達8個樣本中的蛋白質進行定量比較，能夠對正常與疾病、治療前后、疾病過程、細胞培養(yǎng)等不同狀態(tài)下蛋白質定性和定量的表達差異進行研究。③iTRAQ試劑可以標記修飾后的氨基酸，因此可以對磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻譯后修飾蛋白進行定量和定性研究，從中可以獲得更為詳盡的樣品信息。④iTRAQ試劑的報告離子為小分子物質，因此在質譜圖中很容易與其他多肽片段離子區(qū)分，保證了定量的準確性。⑤標記過程更簡單，質譜檢測更為靈敏［11］。

同其他蛋白質組學技術一樣，目前iTRAQ技術仍存在一些缺陷:數(shù)據(jù)復雜度高，因此需要開發(fā)更多的信息學工具;iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中的所有蛋白結合，容易受樣本中的雜質蛋白及樣本處理過程中緩沖液的污染，需要對樣本進行預處理;iTRAQ試劑仍非常昂貴，這也一定程度上制約了它的廣泛應用［12］。

2 iTRAQ技術在真菌研究中的應用

目前蛋白質組學在醫(yī)學真菌學中的應用主要集中于對某些真菌雙相性的了解、宿主反應、細胞壁、毒力因子、藥物抵抗等方面，為了解真菌病發(fā)病機制和藥物開發(fā)等打下了基礎［13］。運用iTRAQ技術動態(tài)、定量地分析真菌生理、病理不同狀態(tài)下蛋白質的差異表達譜，對于分析真菌的致病機制，探討真菌與宿主的互相作用及尋找新的藥物靶標具有重要作用。

2.1 在曲霉研究中的應用

為了研究卡泊芬凈 (Caspofungin)對煙曲霉(Aspergillus fumigams)藥物作用潛在的生物標記，Cagas等［14］用iTRAQ技術比較了藥物作用前后煙曲霉蛋白質表達譜的差異，結果顯示在可溶性和細胞壁/細胞質膜的蛋白質中有471個蛋白呈特異性表達。此外，總計有122個蛋白的差異表達水平至少超過2倍，其中線粒體缺氧反應蛋白的差異表達水平達 16倍以上。Sunil等［15］運用 iTRAQ結合LC-MS/MS技術進行了黑曲霉 (Aspergillus niger)及其在不同pH條件下突變體的分泌蛋白質組學研究。結果共鑒定了102個蛋白質，包括許多水解酶，如纖維素酶、半纖維素酶、過氧化物酶等。研究同時發(fā)現(xiàn)，特定的酶產(chǎn)物可以通過控制培養(yǎng)基的pH值變化獲得。

2.2 在隱球菌研究中的應用

為了找出與生物膜現(xiàn)象相關的生物信號分子，從分子水平闡明隱球菌生物膜的發(fā)生及發(fā)展機制，賈紅玲［16］從新生隱球菌生物膜狀態(tài)與懸浮狀態(tài)細胞外泌蛋白方面進行iTRAQ比較蛋白質組學研究。研究共發(fā)現(xiàn)3種差異蛋白分別為:FIP-FVE、Cation-transporting atpase及 Zincmetallopeptidase mde10，其中FIP-FVE是近年來從一些高等擔子菌子實體中提取的與植物凝集素和免疫球蛋白的結構和功能相似的一類小分子蛋白質，其余兩種在真菌蛋白數(shù)據(jù)庫中的信息還未發(fā)現(xiàn)，具體的功能可能需要參照其他物種的生物學功能。腐殖隱球菌(Cryptococcus humicola)是一種具有高度鋁耐受性的真菌，為了解其鋁耐受性的遺傳基礎，Jingjing Zhang等［17］運用iTRAQ技術對腐殖隱球菌經(jīng)過鋁應力影響前后的蛋白質學變化作了研究。共鑒定了625個蛋白質，其中59個顯著差異蛋白具有統(tǒng)計學意義。隨后進行蛋白質功能研究發(fā)現(xiàn)29個上調蛋白主要參與翻譯、核糖體結構構成和生物合成等，而30個下調蛋白主要參與了能量代謝、翻譯后修飾等。這些功能性的改變有利于保護細胞免受鋁毒性損害。

2.3 在鐮刀菌研究中的應用

Rebecca等［18］應用 iTRAQ技術研究了禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)在侵犯宿主初期合成并分泌真菌毒素時的蛋白質水平變化，數(shù)據(jù)經(jīng)篩選過濾發(fā)現(xiàn)共有435個顯著差異表達蛋白，其中有72個上調蛋白。這些上調蛋白經(jīng)過2-D PAGE/MS/MS鑒定，結果與iTRAQ所得結果一致。隨后通過RT-PCR和Northern印跡雜交驗證發(fā)現(xiàn)，這些上調蛋白的編碼基因在真菌毒素合成期轉錄活性增高。Amalia等［19］用尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的小分生孢子感染蠟螟幼蟲——一種檢測固有免疫的無脊椎動物模型，結合iTRAQ技術分別研究在25℃和37℃時控制組和幼蟲免疫組的差異表達蛋白。共鑒定得到超過50個差異表達蛋白，其中有17個可能與免疫相關，且當溫度從25℃升高到37℃時，一些蛋白表達明顯上調。通過生物信息學分析表明，這些免疫相關差異表達蛋白參與轉運、免疫應答、氧化還原、分解代謝等進程。

2.4 在其他真菌研究中的應用

Ross等［1］于 2004年率先用 iTRAQ-MS/MS 技術比較了野生型啤酒酵母和兩種基因缺陷型突變體的蛋白質組，證明該技術不僅可以提高蛋白質組表達差異分析的覆蓋率，而且可以改善肽鏈斷裂模式。Debra等［20］應用iTRAQ技術分析了兩株不同基因型的釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中3個不同時間點的蛋白質組學差異，并進行了gene ontology(GO)分析。結果表明隨著時間的變化菌株之間的蛋白差異與代謝酶及其相關基因變化密切相關，同時對兩菌株不同表現(xiàn)型的分子起源提出了假說。含油酵母(Oleaginous yeast)細胞內脂質積累的特性已被廣泛研究用于生物能源領域。為了研究含油酵母高脂質聚集的機制，Jiahua Shi［21］等應用ITRAQ及LC-MS/MS技術對一株非含油釀酒酵母及兩株含油酵母進行蛋白質組學研究。在早期、中期、晚期脂質積聚階段，分別有132個、122個及116個蛋白質被鑒定，并成功檢測到脂質合成及調控的相關必需蛋白。畢赤酵母表達系統(tǒng)是通用的、高效的外源蛋白表達系統(tǒng)，廣泛地應用于生產(chǎn)和表達各種外源蛋白。Xiao-qiong Lin等［22］通過iTRAQ技術對3個甲醇誘導產(chǎn)xyn10酶菌株(G1、G4、G4-H)進行分析，G0菌株作為對照。對質譜數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，鑒定得到1 167個蛋白質，包括352個差異蛋白。隨后對差異蛋白進行了GO分析和KEGG代謝途徑分析，探究了蛋白表達的相關機制。研究還發(fā)現(xiàn)過量表達xyn10酶的調控基因HAC1會對菌株的生長造成一定的抑制，蛋白質組學分析可能是由于參與核糖體蛋白表達的蛋白表達降低而造成的。包括黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)在內的擔子真菌具有分泌大量氧化水解酶及降解木質纖維素類生物質 (lignocellulosic biomass)的生物特性，對研究木質纖維素生物質能具有重要價值。Arulmani等［23］應用iTRAQ結合LC-MS/MS技術檢測黃孢原毛平革菌分別在纖維素、木質素及纖維素與木質的混合物培養(yǎng)條件下分泌蛋白的差異。結果共有117個酶被鑒定。在纖維素和纖維素、木質素混合物培養(yǎng)條件下，內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶等顯著上調且氧化、水解的纖維素被降解。當木質素為主要碳源時，銅自由基氧化酶、異戊氧化酶等表達并顯著上調。小麥條銹病由專性寄生真菌小麥條銹菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起，在世界范圍內廣泛流行。小麥抗條銹病基因WKS1表現(xiàn)出對條銹病不同生理亞種的廣譜抗性，能有效降低條銹病危害，減少產(chǎn)量損失。李坤等［24］利用iTRAQ技術，以WKS1基因近等基因系RSL65(含WKS1)和LDN(不含WKS1)為材料，研究不同材料間和接菌前后的差異表達蛋白，鑒定得到861種蛋白。與LDN接菌前樣品相比，RSL65接菌前、RSL65接菌后、LDN接菌后的3種樣品有58種蛋白均表現(xiàn)顯著差異，其中26種蛋白表達上調，32種蛋白表達下調。差異表達蛋白多與細胞器構成、光合作用和轉錄激活相關，主要參與代謝過程、信號傳遞、防御和抗脅迫等生物過程。

3 小 結

比較蛋白質組學是當今蛋白質組學研究的重要領域，比較不同生理和病理狀態(tài)下細胞內蛋白質的表達及修飾，對于揭示生理和病理過程具有重要意義。iTRAQ技術作為一種新的、功能強大的比較質白質組學技術，比較于2D-DIGE、ICAT等傳統(tǒng)技術，具有高通量、重復性好、能夠處理復雜樣本等優(yōu)點，其在真菌研究中的應用價值已得到初步驗證，但對真菌與宿主相互作用過程中的蛋白質組學變化仍研究較少，因此對病原真菌與宿主相互作用的研究可能是真菌比較蛋白質組學新的研究方向之一。盡管iTRAQ技術仍存在一些缺點和不足，但隨著蛋白質組學及生物信息學等技術的不斷完善，iTRAQ技術將會成為真菌比較蛋白質組學研究的重要技術手段，從而為探究真菌致病機制、尋找新的抗真菌藥物靶標等起到推動作用。

［1］ Ross PL，Huang YN，Marchese JN，et al.Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents［J］.Mol Cell Proteomics，2004，3(12):1154-1169.

［2］ Phanstiel D，Unwin R，Mcalister GC，et al.Peptide quantification using 8-plex isobaric tags and electron transfer dissociation tandem mass spectrometry［J］.Anal Chem，2009，81(4):1693-1698.

［3］ Pandey A，Mann M.Proteomics to study genes and genomes［J］.Nature，2000，405(6788):837-846.

［4］ Pierce A，Unwin RD，Evans CA，et al.Eight-channel iTRAQ enables comparison of the activity of six leukemogenic tyrosine kinases［J］.Mol Cell Proteomics，2008，7(5):853-863.

［5］ 王林纖，戴勇，涂植光.iTRAQ標記技術與差異蛋白質組學的生物標志物研究［J］.生命的化學，2010，30(1):135-140.

［6］ Schwacke JH，Hill EG，Krug EL，et al.iQuantitator:a tool for protein expression inference using iTRAQ［J］.BMCBioinformatics，2009，10:342，doi:10.1186/1471-2105-10-342.

［7］ Shadforth IP，Dunkley TP，Lilley KS，et al.i-Tracker:for quantitative proteomics using iTRAQ［J］.BMC Genomics，2005，6:145.

［8］ 謝秀枝，王欣，劉麗華，等.iTRAQ技術及其在蛋白質組學中的應用［J］.中國生物化學與分子生物學報，2011，27(7):616-621.

［9］ Gygi SP，Rist B，Gerber SA，et al.Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags［J］.Nat Biotechnol，1999，17(10):994-999.

［10］ Wu WW，Wang G，Baek SJ，et al.Comparative study of three proteomic quantitative methods，DIGE，cICAT，and iTRAQ，using 2D gel-or LC-MALDI TOF/TOF［J］.J Proteome Res，2006，5(3):651-658.

［11］ Wiese S，Reidegeld KA，Mayer HE，et al.Protein labeling by iTRAQ:a new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research［J］.Proteomics，2007，7(3):340-350.

［12］ Martyniuk CJ，Alvarez S，Denslow ND.DIGE and iTRAQ as biomarker discovery tools in aquatic toxicology［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2012，76(2):3-10.

［13］ 汪曉軍，溫海.蛋白質組學在醫(yī)學真菌研究中的應用進展［J］.中國真菌學雜志，2008，3(3):181-185.

［14］ Cagas SE，Jain MR，Li H，et al.Profiling the Aspergillus fumigatus proteome in response to caspofungin［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55(1):146-54.

［15］ Adav SS，Li AA，Manavalan A，et al.Quantitative iTRAQ secretome analysis of Aspergillus niger reveals novel hydrolytic enzymes［J］.J Proteome Res，2010，9(8):3932-3940.

［16］ 賈紅玲.新生隱球菌生物膜外分泌蛋白初步分析的研究［D］.上海:第二軍醫(yī)大學，2012，doi:10.7666/d.y2110925.

［17］ Zhang JJ，Zhang L，Qiu JK，et al.Isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)-based proteomic analysis of Cryptococcus humicola response to aluminum stress［J］.J Biosci Bioeng，2015，doi:10.1016/j.jbiosc.2015.02.007.［Epub ahead of print］

［18］ Taylor RD，Saparno A，Blackwell B，et al.Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions［J］.Proteomics，2008，8(11):2256-2265.

［19］ Munoz-Gomez A，Corredor M，Benitez-Paez A，et al.Development of quantitative proteomics using iTRAQ based on the immunological response of Galleria mellonella larvae challenged with Fusarium oxysporum microconidia［J］.PLoS One，2014，9(11):e112179.

［20］ Rossouw D，Van den Dool AH，Jacobson D，et al.Comparative transcriptomic and proteomic profiling of industrial wine yeast strains［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76(12):3911-3923.

［21］ Shi JH，F(xiàn)eng HX，Lee J，et al.Comparative proteomics profile of lipid-cumulating oleaginous yeast:an iTRAQ-coupled 2-D LCMS/MSanalysis［J］.PLoSOne，2013，8(12):e85532.

［22］ Lin XQ，Liang Sl，Han SY，et al.Quantitative iTRAQLC-MS/MS proteomics reveals the cellular response to heterologous protein overexpression and the regulation of HAC1 in Pichia pastoris［J］.J Proteomics，2013，91:58-72.

［23］ Manavalan A.，Adav SS，Sze SK.iTRAQ-based quantitative secretome analysis of Phanerochaete chrysosporium［J］.J Proteomics，2011，75(2):642-654.

［24］ 李坤.小麥抗條銹基因WKS1相關的蛋白組學及重組基因創(chuàng)建［D］.山東農(nóng)業(yè)大學，2012.