時(shí)間分辨熒光免疫法檢測腦脊液結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的診斷價(jià)值

馬春靜,鄒薇,王麗.齊齊哈爾建華醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江齊齊哈爾　6000；.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院輸血科，黑龍江齊齊哈爾　6000；.齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江齊齊哈爾　6000

時(shí)間分辨熒光免疫法檢測腦脊液結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的診斷價(jià)值

馬春靜1,鄒薇2,王麗3
1.齊齊哈爾建華醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江齊齊哈爾161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院輸血科，黑龍江齊齊哈爾161000；3.齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江齊齊哈爾161000

[摘要]目的對時(shí)間分辨熒光免疫法檢測腦脊液結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的診斷價(jià)值進(jìn)行研究。方法整群選取2012年6月—2013年6月于該院確診為結(jié)核性腦膜炎患者48例，收集患者的腦脊液，建立時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測腦脊液中ESAT-6-CFP10抗原。同時(shí)采用TRIFA法和ELISA法對結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液檢查特異度進(jìn)行檢測。結(jié)果ESAT6/CFP10 的TRIFA法穩(wěn)定性好，線性寬，其檢測靈敏度為2.5 ng/mL，平均回收率為97.6%，批內(nèi)變異系數(shù)平均為3.35%，批間CV平均為5.32%。TRFIA法結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液檢查特異度為92.6%，明顯高于ELISA法的82.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，χ2=5.5311）。結(jié)論TRFIA法敏感度、精密度、重復(fù)性、線性相關(guān)性較好，檢測腦脊液中ESAT-6-CFP10抗原對診斷結(jié)核性腦膜炎有很高的敏感度和特異度。

[關(guān)鍵詞]時(shí)間分辨熒光免疫法；檢測；腦脊液；結(jié)核分枝桿菌；特異性抗原

結(jié)核性腦膜炎(TBM)是臨床上比較嚴(yán)重的致命性的結(jié)核病類型之一，患者患該病時(shí)，預(yù)后比較差，往往可能會危及生命安全[1]。目前來說，結(jié)核性腦膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是在患者的腦脊液中檢測到結(jié)核分枝桿菌(MTB)的存在。在感染早期，致病型結(jié)核分枝桿菌一般會分泌大量的特異性蛋白，即6000-早期分泌性抗原靶（ESAT-6）與抗原培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10），并且這兩種蛋白不存在在卡介苗BCG中，故其可以作為活動(dòng)性結(jié)核的標(biāo)志物。時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）法是以鑭系元素為示蹤物，代替熒光物質(zhì)酶同位素化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗體抗原激素多肽蛋白質(zhì)核酸探針及生物細(xì)胞，大幅度降低了非特異性結(jié)合并提高了靈敏度，其靈敏度高，穩(wěn)定性和，而且檢測限也比較寬[2]，故通過建立檢測ESAT6/CFP10融合蛋白的TRFIA方法，探討其是否能夠很好的用于結(jié)核性腦膜炎的診斷。

1　資料與方法

1.1一般資料

整群選取2012年6月—2013年6月于該院進(jìn)行治療的確診為結(jié)核性腦膜炎患者48例，其中男25例，女23例，年齡22～66歲，平均年齡（43.4±3.5）歲。根據(jù)病史、輔助檢查、短期抗結(jié)核治療效果臨床診斷為結(jié)核性腦膜炎。

1.2試劑與儀器

DR6608型TRFIA檢測儀由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供；Eu3+標(biāo)記試劑盒及發(fā)光增強(qiáng)液購于美國Wallac公司；96孔微孔板購于美國corning公司；結(jié)核分枝桿菌ESAT6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒由上海寶曼生物科技有限公司提供；ESAT6/CFP10融合蛋白及其單克隆抗體（IgG）與多克隆抗體（IgG）由上海博研生物科技有限公司提供[3]。

1.3方法

常規(guī)腰椎穿刺抽取患者腦脊液2 mL，每管0.5 mL分裝，存放于-20℃待分批測定CFPl0和ESAT-6，所有操作均嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。運(yùn)用雙抗體夾心法，先在微孔內(nèi)包被一層ESAT-6-CFP10融合蛋白單克隆抗體，然后加入100 uL各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，在常溫下振蕩孵育1h，洗滌3次，5 min/次，然后加入稀釋100倍的Eu3+＋－抗ESAT-6-CFP10融合蛋白多克隆抗體100 uL，常溫下振蕩孵育1 h，洗滌6次，5 min/次，再加入100 uL增強(qiáng)液，孵育5 min，將其放入時(shí)間分辨熒光儀進(jìn)行熒光檢測，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測繪，然后根據(jù)方程進(jìn)行樣品中ESAT-6-CFP10二聚體蛋白的含量的計(jì)算[4]。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS15.0，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ESAT6/CFP10融合抗原

TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制經(jīng)過計(jì)算，方程為y=1.2274x+ 2.6879，R2=0.9959。而且從圖可以得出，ESAT-6-CFP10二聚體蛋白的含量與熒光計(jì)數(shù)成正比關(guān)系。

圖1　ESAT6/CFP10抗原的TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2回收

試驗(yàn)在濃度為5.4 ng/mL的ESAT6/CFP10的1 mL健康人血清中，分別加入各1 mL濃度為25、200、400 ng/mL的ESAT6/ CFP10標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算樣本回收率?；厥章史謩e為96.9%、98.5%、98.3%，平均回收率為97.6%。

2.3精密度

在熒光計(jì)數(shù)值高、中、低值中隨機(jī)選取3份ESAT-6-CFP10樣品，每天平行測定20孔，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)CV，得出結(jié)果分別為4.3%、3.2%、2.6%，平均為3.35%；連續(xù)檢測20個(gè)工作日，計(jì)算批間變異系數(shù)CV，得出結(jié)果分別為5.6%、5.21%、4.9%，平均為5.32%。

2.4靈敏度

選取不同濃度的ESAT6/CFP10融合蛋白2.5、5、10、25、50、100、500 ng/mL進(jìn)行檢測。最后結(jié)果為，ELISA法檢出最低限為25 ng/mL，TRFIA法檢出最低限為2.5 ng/mL。同時(shí)選擇經(jīng)檢測熒光值較高的1例結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液標(biāo)本進(jìn)行倍比稀釋至132 768，用TRFIA法與ELISA法同時(shí)進(jìn)行抗原的檢測。ELISA法的最低陽性檢出14 096，而TRFIA法在132 768時(shí)仍為陽性。

2.5檢查結(jié)果分析

TRFIA法結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液檢查特異度為92.6%，明顯高于ELISA法和結(jié)核分枝桿菌涂片或培養(yǎng)法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2值分別為5.5311、13.121，P均＜0.05。TRFIA法與ELISA法和結(jié)核分枝桿菌涂片或培養(yǎng)法在敏感度比較方面，三者并差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2值分別為2.1334、2.134，P>0.05。

表1　檢查結(jié)果分析（%）

3　討論

近年來，結(jié)核的發(fā)病率有上升的趨勢，其感染源主要為結(jié)核分枝桿菌，它是典型的胞內(nèi)寄生菌，活動(dòng)期結(jié)核性腦膜炎病人腦脊液中的結(jié)核桿菌可以被單核巨噬細(xì)胞吞噬，巨噬細(xì)胞提供了結(jié)核桿菌隱藏和繁殖的場所，同時(shí)還起到濃縮結(jié)核桿菌抗原的作用[5]。分離培養(yǎng)是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但最大的缺點(diǎn)是檢測周期太長，嚴(yán)重滯后于臨床診治，也不能確定是否為結(jié)核分枝桿菌感染。當(dāng)機(jī)體受到結(jié)核桿菌感染后，體內(nèi)首先會出現(xiàn)結(jié)核抗原，可作為機(jī)體是否發(fā)生了該疾病的感染，而且特異性強(qiáng)。

CFP10和ESAT6是由結(jié)核桿菌在早中期分泌釋放于菌體外的一組相對分子質(zhì)量較低的蛋白，都是由結(jié)核分枝桿菌RD.1基因編碼，主要存在于人型和致病性牛型結(jié)核分枝桿菌中，在卡介苗中缺失[6]。因此可作為活動(dòng)性結(jié)核的標(biāo)志物，在卡介苗菌株和大部分環(huán)境中的分枝桿菌基因中則缺乏該序列，不受卡介苗接種干擾，可以避免假陽性，故具有診斷性抗原的優(yōu)勢。另外，ESAT6和CFP10的融合蛋白綜合了單一抗原的優(yōu)勢，具有更強(qiáng)大的活化能力，比單一抗原更為敏感，而且并不降低特異性[7]。TRFIA法利用了具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物，靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，同時(shí)可以定量檢測[8]。

該研究將TRFIA方法應(yīng)用于定量測定ESAT-6-CFP10抗原的含量，結(jié)果顯示，TRFIA方法檢測的靈敏度非常高，最低檢出限可以達(dá)到2.5 ng/mL，而且其具有較寬的檢測范圍，特異性較好，TRFIA法結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液檢查特異度為92.6%，明顯比常規(guī)的ELISA法和結(jié)核分枝桿菌涂片或培養(yǎng)法高，表明時(shí)間分辨熒光免疫法檢測腦脊液結(jié)核分枝桿菌特異性抗原對早期診斷具有重要的意義。國內(nèi)學(xué)者李新玲等[9]同樣采用時(shí)間分辨熒光免疫法對腦脊液結(jié)核分枝桿菌特異性抗原進(jìn)行了檢測，其數(shù)據(jù)也表明TRFIA方法具有較高的敏感度，而且特異性也好，與該研究數(shù)據(jù)先符合，表明該研究結(jié)果具有一定的可靠性。

目前用TRFIA法測ESAT6/CFP10抗原可作為優(yōu)于其他輔助檢查的一項(xiàng)新的檢查手段用于臨床結(jié)核分枝桿菌感染的早期診斷，隨著研究的進(jìn)一步深入，該方法有可能成為簡便地診斷結(jié)核病的一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)；且該方法對檢測條件的要求不高，結(jié)果可靠，對加強(qiáng)結(jié)核病的預(yù)防控制有重要意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1]胥國強(qiáng),蒲澤宴,康清秀,等.TRFIA法和ELISA法在HBsAg檢測中的方法學(xué)評價(jià)[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2013,24(1)：31-32,71.

[2]張昆南,許自強(qiáng),王朝東,等.腦脊液中檢測結(jié)核分枝桿菌特異性抗原對結(jié)核性腦膜炎的診斷意義[J].中華神經(jīng)科雜志,2011,44(2)：86-90.

[3]吳曉牧,劉麗娟,許志強(qiáng),等.早期診斷結(jié)核性腦膜炎的新方法檢測濃縮腦脊液中CFP-10和ESAT-6[J].中國免疫學(xué)雜志,2012,28(4)：347-350.

[4]郭旻,范學(xué)文.結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原ESAT-6對結(jié)核性腦膜炎診斷價(jià)值的研究[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志,2011,33(1)：3-5.

[5]張昆南,文安,楊赟,等.ELISA法檢測濃縮腦脊液ESAT-6對結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2014,21(5)：360-363.

[6]朱云鳳,顧德林,王天樂,等.結(jié)核抗原時(shí)間分辨熒光免疫分析的建立及其初步臨床應(yīng)用[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2014(9)：938-941.

[7]宋孚霞,孫旭文,王曉彤,等.結(jié)核性腦膜炎腦脊液結(jié)核分枝桿菌抗原的動(dòng)態(tài)變化分析[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2011,18(2)：119-121.

[8]胡志剛,劉潔,陳國千,等.生物素-親合素系統(tǒng)-時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測抗核抗體方法學(xué)的建立和臨床應(yīng)用[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2012,16(3)：196-199.

[9]李新玲,黃懷宇,吳俊淵,等.時(shí)間分辨熒光免疫法檢測腦脊液結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的診斷價(jià)值[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(18)：4168-4170.

Detection of Specific Antigen of Mycobacterium Tuberculosis in Cerebrospinal Fluid by Time -resolved Fluoroimmunoassay and Its Diagnostic Value

MA Chun-jing1, ZOU Wei2, WANG Li3
1.Department of Clinical Laboratory, QiqiharJianhua Hospital , Qiqihar, Heilongjiang, 161000 China; 2.Department of Blood Transfusion, Second Affiliated Hospital of Qiqhar Medical University, Qiqihar, Heilongjiang, 161000 China; 3.Department of Clinical Laboratory, Qiqihar Hospital of Traditional Chinese Medicine, Qiqihar, Heilongjiang, 161000 China

[Abstract]Objective To investigate the application of the time-resolved fluoroimmunoassay (TRIFA) in detecting the specific antigen of mycobacterium tuberculosis in cerebrospinal fluid and evaluate its diagnostic value. Methods The ESAT6/CFP10 antigen in the cerebrospinal fluid of 48 patients who were confirmed with tuberculous meningitis in our hospital during June 2012 and June 2013 were detected by time-resolved fluoroimmunoassay. For the diagnosis of tuberculous meningitis, the specificity of TRIFA in detecting the specific antigen of mycobacterium tuberculosis and that of the ELISA was compared. Results In detecting ESAT6/CFP10 antigen, TRIFA was stable and wide in linearity range, and its sensitivity, the mean recovery rate, the within-run and interday-run coefficients of variation were 2.5 ng/mL, 97.6%, 3.35%, 5.32%, respectively. The specificity of TRIFA in detecting the specific antigen of mycobacterium tuberculosis was 92.6%, obviously higher that of ELISA, 82.4%, and the difference was statistically significant（P<0.05,χ2=5.5311）. Conclusion With good sensitivity, precision, repeatability and linear correlation, TRFIA applied in the detection of ESAT6/CFP10 antigen in the cerebrospinal fluid has high sensitivity and specificity for the diagnosis of tuberculous meningitis.

[Key words]Time-resolved fluoroimmunoassay; Detection; Cerebrospinal fluid; Mycobacterium tuberculosis; Specific antigen

[中圖分類號]R378.9

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）－0074-02

[作者簡介]馬春靜（1978.6-），女，遼寧遼中縣人，本科，主管檢驗(yàn)師，研究方向：檢驗(yàn)。

收稿日期：（2015-04-25）