外燥對小鼠氣道免疫及分泌功能的影響研究

胡利群，丁建中，劉國平.武漢市新洲區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢　430040；.長江大學(xué)，湖北荊州　43405

外燥對小鼠氣道免疫及分泌功能的影響研究

胡利群1，丁建中2，劉國平2
1.武漢市新洲區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢430040；2.長江大學(xué)，湖北荊州434025

[摘要]目的探討外燥對昆明種小鼠呼吸道的局部免疫及分泌功能的影響，研究外燥致病的病機。方法該實驗自2009年10月—2010年5月完成。將120只SPF級昆明種小鼠隨機分為溫燥組，常溫燥組，常溫常濕組，涼燥組等4組，每組30只。在第六、十二、十八天處理后，對各組氣道灌洗液中黏多糖，SIgA和IgG等指標(biāo)進行檢測。結(jié)果黏多糖含量在溫燥組第十二、十八天降低；涼燥組則第十二天最低（P <0.05）。溫燥組第六到十八天，SIgA含量持續(xù)下降。IgG含量第六到十八天溫燥組和常溫燥組持續(xù)下降，且溫燥組下降更顯著。結(jié)論外燥可導(dǎo)致肺衛(wèi)失衡、肺津液生成減少、呼吸道的“纖毛-黏液毯”的免疫屏障功能；減弱，為研究外燥傷肺提供實驗基礎(chǔ)資料。

[關(guān)鍵詞]外燥氣道；免疫功能；分泌功能

燥邪為六氣之變。外感六氣之一中的外燥,是一種非常重要的致病因素。其產(chǎn)生主要與溫度及相對濕度相關(guān)。因寒熱相兼的不同,外燥有涼燥和溫燥之分，兩者基本病機都為“燥勝則干”[1]?！霸镌谏希爻朔?。肺者，…通于秋氣。”和“燥勝則干”等中醫(yī)經(jīng)典理論都指出燥邪特點形成與時令有關(guān)[2]。六淫犯肺的實質(zhì)是諸邪與體內(nèi)微觀物質(zhì)相互作用的異常表現(xiàn)形式[3]。

氣道黏膜分泌的氣道液主要成分為黏多糖和蛋白質(zhì)。其覆蓋于氣管黏膜表面形成黏液毯，可參與“纖毛－黏液毯”局部免疫屏障。一方面，可以潤濕氣道黏膜表面，另外，也能保護上皮纖毛的運動。大量的黏液難以排出而儲留于氣管腔并形成黏液栓，可導(dǎo)致或加重氣道阻塞、病原菌易定植，抗生素難以滲入并在細(xì)菌駐留的黏液中達(dá)到殺菌濃度而導(dǎo)致反復(fù)感染和誘發(fā)細(xì)菌耐藥性[4]。檢測黏多糖可作為監(jiān)測氣道腺體分泌功能的量化指標(biāo)[5]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實，體液中的小分子物質(zhì)如抗體、細(xì)胞因子等起著重要的免疫防御作用，與機體“正氣內(nèi)存，邪不可干”相關(guān)。在外燥致肺部炎性病理改變的基礎(chǔ)上，該實驗自2009年10月—2010年5月完成，將120只SPF級昆明種小鼠隨機分為溫燥組，常溫燥組，常溫常濕組，涼燥組等4組，每組30只。在第六、十二、十八處理后，對各組氣道灌洗液中黏多糖，SIgA和IgG等指標(biāo)進行檢測。觀察外燥對昆明種小鼠呼吸道的局部免疫及分泌功能的影響，為研究外燥病機提供實驗基礎(chǔ)資料。

1　資料與方法

1.1一般資料及分組情況

1.1.1動物該實驗自2009年10月—2010年5月完成。無特定病原體級昆明種小鼠120只，雌雄各半，體重（17±1）g。由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號:SCXK(鄂) 2008－2005。

1.1.2主要儀器和試劑LG風(fēng)扇程控儀，LRH-250人工智能氣候箱，BEP-Ⅲ酶標(biāo)儀。咔唑，小鼠IgG單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量試劑盒,小鼠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA試劑盒。

1.1.3動物分組與造模將小鼠隨機分為溫燥組，常溫常濕組、常溫燥組和涼燥組等四組，每組30只，按文獻(xiàn)造模[6]，于人工智能氣候箱內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。第六、十二、十八天處理后，檢測相關(guān)項目。

1.2實驗方法及觀察指標(biāo)

1.2.1呼吸道液黏多糖（RS）測定(ng/mL)采用咔唑比色法檢測。標(biāo)本：將各組實驗小鼠斷頸處死，暴露氣管，常規(guī)氣管插管，將37℃生理鹽水1 mL緩慢推注氣管，回抽，重復(fù)2次，離心取上清液當(dāng)天檢測RS。主要步驟:取50 μL標(biāo)本稀釋5倍稀釋，加四硼酸硫酸鈉溶液2.5 mL，置沸水中10 min，取出冷卻至室溫后，加100 μl咔唑液后再置沸水中15 min，取出冷卻至室溫后，用紫外分光光度計測定OD值。用3 mmol/L氯化鈉稀釋D-葡萄糖醛酸內(nèi)酯儲存液成25～300 ug/mL并制作工作曲線（n=8,r=0.8992）。每份標(biāo)本重復(fù)測定2次，

1.2.2SIgA和IgG通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中含量。檢測采用ABC-ELISA試劑盒法。標(biāo)本來源同1.2.1。利用自動酶標(biāo)儀495nm測定OD值，以包被液作空白對照，PBS pH7.4（10%小牛血清）作陰性對照。依標(biāo)準(zhǔn)曲線求其含量。

1.3統(tǒng)計分析

2　結(jié)果

2.1外燥對小鼠氣道液黏多糖的影響

與正常的常溫常濕組比較，溫燥組第六天RS升高，但第十二、第十八天持續(xù)明顯下降；常溫燥組第六至第十八天RS持續(xù)升高；涼燥組則是第六天略升高-第十二天最低（P <0.05）-第十八天再升高。見表1。

表1　外燥對小鼠氣道液黏多糖的影響(±s)

表1　外燥對小鼠氣道液黏多糖的影響(±s)

注：與常溫燥組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。組內(nèi)比較第六天與第十二天比較，●P＜0.01；第六天與第十八天比較,＃P＜0.05。第十二天與第十八天比較,△P＜0.01。

溫燥組（n=10）常溫燥組（n=10）常溫常濕組（n=10）涼燥組（n=10）組別313.98±138.68 409.21±217.87 281.48±106.71 298.78±35.56 (236.51±41.55)*294.54±62.32 270.97±66.71 (202.98±22.85)**●(187.75±64.17)**＃321.01±66.76 (227.75±66.35)**(275.02±38.39)△氣道液黏多糖（μg/ml）第六天　第十二天　第十八天

2.2外燥對小鼠氣道液IgG，SIgA的影響

常溫常濕組第六、第十二、第十八天氣道液中SIgA含量穩(wěn)定。常溫燥組第六到十八天SIgA變化不明顯，溫燥組第六、第十二、第十八天SIgA持續(xù)下降，以第十二、第十八天為重(P﹤0.05),同組比較：只有涼燥組第六、第十二天改變不明顯,第十八天出現(xiàn)升高。

表2　外燥對小鼠氣道夜SIgA的影響（±s）

表2　外燥對小鼠氣道夜SIgA的影響（±s）

注：與常溫常濕比較,**P﹤0.01；組內(nèi)第六天與第十八比較＃P﹤0.05。

溫燥組（n=10）常溫燥組（n=10）常溫常濕組（n=10）涼燥組（n=10）組別71.58±30.56 67.36±25.87 73.35±14.84 66.07±26.89 （46.78±23.82）**90.78±35.66 74.42±13.29 72.46±21.09 （47.81±26.31）**88.61±22.68 78.75±14.67 （100.09±40.20）＃SIg-A濃度含量（ng/ml）第六天　第十二天　第十八天

表3顯示，常溫常濕組第六、第十二、第十八天氣道液中IgG含量相對穩(wěn)定。與常溫常濕組比較，常溫燥組、溫燥組IgG第六、第十二、第十八天持續(xù)在常溫常濕組、常溫燥組、溫燥組中下降，以和天為甚（P﹤0.05），涼燥組第六、第十二天下降明顯，但第十八天含量略升高但無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3　外燥對小鼠氣道液IgG的影響（±s）

表3　外燥對小鼠氣道液IgG的影響（±s）

溫燥組（n=10）常溫燥組（n=10）常溫常濕組（n=10）涼燥組（n=10）組別（92.06±28.63）**（140.45±40.26）*198.18±26.28 （137.88±45.14）*112.87±30.81 105.45±36.81 168.79±62.32 130.89±78.32 93.56±21.68 （94.32±43.59）＃（138.40±43.54）＃＃164.79±69.89 IgG（ng/ml）第六天　第十二天　第十八天

注：與常溫常濕組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01;第六天與第十八天比較, ＃P＜0.05，＃＃P＜0.013。

3　討論

外感燥邪，既有外感病的一般臨床表現(xiàn)，又有燥邪傷犯肺系，耗傷津液的癥狀[7]。黏膜上皮及腺體分泌的雙層液體構(gòu)成氣道黏液，其成分以黏蛋白為主，由黏多糖和蛋白質(zhì)組成[8]。肺津液生成減少，可導(dǎo)致組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變及功能受損[9]。以表1中模擬外燥條件資料顯示，溫燥組第六，第十二天黏多糖含量明顯減少。表明外燥可致氣道黏液分泌減弱，使纖毛上皮失去氣道黏液的保護作用，氣道“纖毛-黏液毯”防御功能受損。氣道炎性病邪之物滯凝為黏稠之痰而難以被氣道“纖毛-黏液毯”排出，或聚集于肺泡與肺泡外間質(zhì)引起肺水腫、瘀血而致肺呼吸膜增厚，因為“肺為貯痰之器”，故阻滯“肺通天氣”功能而呈“干咳或痰難咳出”之癥[10]。

SIgA，IgG等抗體分子可與病原微生物特異結(jié)合，啟動免疫防御效應(yīng)，以阻止病原微生物黏附到易感細(xì)胞。從上氣道至周圍氣道，SglA逐漸減少，而IgG趨于增高。多數(shù)抗菌、抗病毒抗體都屬于IgG類抗體，故IgG是呼吸道黏液毯中重要的免疫防御成份之一。表2中顯示，溫燥組第六到十八天SIgA持續(xù)下降。表3顯示，溫燥組、常溫燥組IgG第六、十二、十八天呈下降趨勢，以第十二天顯著。前期參與的課題組研究報道[11]，溫燥組第七天至第十四天氣道液中IgG始終為低水平（P＜0.01），該實驗結(jié)果與前期研究相符。實驗從一個側(cè)面證實，外燥可能導(dǎo)致氣道分泌液減少，同時因某種原因使與肺“衛(wèi)氣”有關(guān)的SIgA和IgG始終處于低水平，有理由認(rèn)為氣道SIgA、IgG抗體持續(xù)下降與溫燥致病機制密切相關(guān)。與丁建中[11]教授研究的同期氣道SIgA與IgG持續(xù)下降而削弱氣道的“免疫屏障”功能導(dǎo)致“肺衛(wèi)失合”相符。表明氣道分泌液減少，氣道局部免疫屏障減弱是外燥致病的重要基本病機之一。氣道的局部免疫屏障功能受損,與外燥病因病機密切相關(guān)。此結(jié)果為研究外燥傷肺分子病機的特征性指標(biāo)提供重要實驗依據(jù)。

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Study on Effects of External Dryness to the Airway Immune and Secretory Function of Mice

HU Li-qun1, DING Jian-zhong2, LIU Guo-ping2
1. Xinzhou District Center for Disease Control and Prevention, Wuhan, Hubei Province, 430040 China; 2.The Yangtze University, Jingzhou, Hubei Province, 434025 China

[Abstract]Objective To observe the effect of external dryness on the local immune and secretion function of the respiratory tract in Kunming mice, and to study the pathogenesis of the disease. Methods This experiment was completed from October 2009 to May 2010. 120 SPF mice were randomly divided into warm dry group, normal temperature and dry group, normal temperature and humidity group and cool dry group, four groups, 30 in each group. After treatment of 6, 12, 18 days, the index for mucopolysaccharides, SIgA and IgG of the Airway lavage fluid in each group were detected. Results The content of Mucopolysaccharides decreased in warm dry set of the 12th and 18th day, cool and dry group was lowest on 12th day (P<0.05). The SIgA content continued to decrease in warm dry set from the 6th to 18th day. IgG content continued to decline in warm dry and normal temperature and dry set from the 6th to 18th day, and the warm dry set decreased more significantly. Conclusion External dryness may lead to immune barrier function of lung health imbalance, lung fluid formation decreased, the immune barrier function to“cilia and mucus blanket”of respiratory tract weakened, which provides the experimental basis for the study of lung with dry injury.

[Key words]External dryness; Airway; Immune function; Secretion function

[中圖分類號]R254

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）－0019-03

[作者簡介]胡利群（1974-），女，湖北武漢人，碩士，主管技師。

[通訊作者]劉國平（1974-），男，湖北武漢人，博士副教授。

收稿日期：（2015-04-23）