醌氧化還原酶2下調(diào)對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響

蔡靜波 季鵬 尹紅麗 王嵐 郭紅梅

醌氧化還原酶2下調(diào)對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響

蔡靜波 季鵬 尹紅麗 王嵐 郭紅梅

目的 研究醌氧化還原酶2(NQO2)下調(diào)對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RASMCs)線(xiàn)粒體膜電位的影響。 方法 將RASMCs分為3組:野生型組、陰性對(duì)照組和NQO2下調(diào)組。利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)體外培養(yǎng)的RASMCs中 NQO2, 采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)滲入法檢測(cè)細(xì)胞增殖,用陽(yáng)離子染料JC-1標(biāo)記RASMCs線(xiàn)粒體內(nèi)膜并檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位,試劑盒法檢測(cè)總超氧化物歧化酶(SOD)活性和細(xì)胞色素C水平。 結(jié)果 在野生型組、陰性對(duì)照組和NQO2下調(diào)組中,BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為(18.94±1.43)%,(18.29±0.92)%和(9.21±1.42)%,NQO2下調(diào)組的細(xì)胞增殖明顯被抑制(P<0.01); 3組細(xì)胞經(jīng)JC-1標(biāo)記后紅色/綠色熒光比值分別為15.48±0.41,15.96±0.52和13.58±0.12,NQO2下調(diào)組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位明顯下降(P<0.01)。細(xì)胞色素C水平在3組細(xì)胞中分別為(9.62±0.29) ng/L,(9.36±0.07) ng/L和(15.83±0.83) ng/L,NQO2下調(diào)組明顯升高(P<0.01)。 結(jié)論 NQO2的下調(diào)可降低RASMCs線(xiàn)粒體膜電位,致細(xì)胞色素C釋放增加,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

線(xiàn)粒體膜電位; 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞; 醌氧化還原酶2; RNA干擾; 凋亡

動(dòng)脈粥樣硬化是公認(rèn)的心腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ),而后者仍然是目前我國(guó)國(guó)民主要的致死、致殘?jiān)?造成極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失[1]。現(xiàn)有研究證實(shí)線(xiàn)粒體功能異?？梢饍?nèi)皮功能障礙、血管平滑肌細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及粥樣斑塊的破裂,誘發(fā)臨床事件[2]。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)采用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)下調(diào)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RVSMCs)中的一種黃素蛋白——醌氧化還原酶2(quinone reductase 2, NQO2)的表達(dá),可降低細(xì)胞內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的水平,阻抑細(xì)胞因子ERK1/2的磷酸化,從而抑制細(xì)胞的增殖[3],但這一過(guò)程是否有線(xiàn)粒體的參與尚不十分清楚。本研究通過(guò)探討下調(diào)NQO2基因?qū)VSMCs線(xiàn)粒體膜電位及其氧化還原功能的影響,從而為在亞細(xì)胞水平上防治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 RASMCs購(gòu)自齊氏生物科技公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、D-Hank’s液、胰蛋白酶消化液購(gòu)自Gibco公司;50 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板為corning公司產(chǎn)品;5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞色素C檢測(cè)試劑盒及JC-1線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技公司;倒置熒光顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠主動(dòng)脈RASMCs的培養(yǎng)與鑒定 RASMCs原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每4 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)用0.125%胰蛋白酶消化液傳代培養(yǎng),第3～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。RASMCs呈梭形,具有“峰-谷樣”的生長(zhǎng)方式。

1.3 RNA干擾慢病毒載體感染RASMCs及實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)前期研究向上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司定制針對(duì)大鼠NQO2 mRNA的RNA干擾慢病毒載體(Psc-NQO2)及陰性對(duì)照載體(Psc-NC)[4]。RASMCs以1×105個(gè)/孔的密度接種于六孔板中,24 h后每孔加入病毒液(滴度為5×108TU/ml)10 μl,孵育12～24 h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的表達(dá)時(shí),更換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組,野生型即正常的RASMCs,陰性對(duì)照組即感染Psc-NC的RASMCs,NQO2下調(diào)組即感染Psc-NQO2的RASMCs。

1.4 Western blotting檢測(cè)NQO2 各組細(xì)胞加預(yù)冷的細(xì)胞裂解液200 μl冰浴30 min,4 ℃、13 000 g離心10 min,取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。樣品經(jīng)蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。一抗為兔抗鼠NQO2(1∶400)和兔抗鼠β-actin(1∶1000),二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG,采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.5 JC-1法檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位 JC-1是一種具有線(xiàn)粒體膜電位依賴(lài)性聚集特性的陽(yáng)離子染料。線(xiàn)粒體膜電位未降低或降低時(shí),JC-1分別發(fā)射紅色和綠色檢測(cè)光,因此可用紅色/綠色熒光比值表示線(xiàn)粒體膜電位的降低。棄去舊培養(yǎng)液,用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的JC-1溶液(終濃度為10 mg/L)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,37 ℃孵育30 min后棄去染料,用GENios Pro reader (Tecan公司,瑞士)進(jìn)行檢測(cè),以紅色/綠色熒光比值表示線(xiàn)粒體膜電位的下降情況。

1.6 BrdU檢測(cè)細(xì)胞凋亡 BrdU作為一種胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物,可在細(xì)胞增殖過(guò)程中參與核酸的合成,因此檢測(cè)BrdU的分布可判斷細(xì)胞增殖的情況。干預(yù)后的細(xì)胞在終止培養(yǎng)前用BrdU(終濃度為30 μg/L)于37 ℃孵育40 min,PBS洗滌細(xì)胞3次,甲醇/醋酸固定10 min,依次加兔抗大鼠BrdU單抗(工作濃度1∶50)和羊抗兔IgG(1∶200),用ABC法檢測(cè),在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 SOD活性及細(xì)胞色素C檢測(cè) 均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活力,采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法測(cè)定細(xì)胞色素C水平。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾降低RASMCs中NQO2水平 經(jīng)western blotting檢測(cè),感染Psc-NQO2 72 h后的RASMCs胞漿內(nèi)NQO2含量較野生型RASMCs降低約77.8%(0.222∶1),而陰性對(duì)照組與野生型組比較,細(xì)胞內(nèi)NQO2水平無(wú)明顯改變(0.923∶1)。見(jiàn)圖1。

注:1為野生型組,2為陰性對(duì)照組,3為NQO2下調(diào)組圖1 Western blotting檢測(cè)RASMCs中NQO2水平

2.2 NQO2下調(diào)對(duì)RASMCs增殖的影響 野生型和陰性對(duì)照組RASMCs中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為(18.94±1.43)%和(18.29±0.92)%,而NQO2下調(diào)組RASMCs中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比率為(9.21±1.42)%,明顯低于前2組(P<0.01)。所以,NQO2下調(diào)可明顯抑制RASMCs增殖。見(jiàn)圖2。

圖2 NQO2下調(diào)對(duì)RASMCs增殖的影響(×100)

2.3 NQO2下調(diào)對(duì)RASMCs線(xiàn)粒體膜電位的影響 NQO2下調(diào)組的紅色/綠色熒光比值為13.58±0.12,明顯低于野生型的15.48±0.41和陰性對(duì)照組的15.96±0.52(P<0.01)。結(jié)果顯示NQO2下調(diào)可使RASMCs線(xiàn)粒體膜電位下降。

2.4 NQO2下調(diào)對(duì)RASMCs總SOD活性及細(xì)胞色素C的影響 NQO2下調(diào)組的總SOD活性較野生型和陰性對(duì)照組升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.224和0.261)。而NQO2下調(diào)組的細(xì)胞色素C水平則明顯高于野生型組和陰性對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

組別總SOD活性(U/ml)細(xì)胞色素C(ng/L)野生型組928.30±53.259.62±0.29陰性對(duì)照組933.10±50.429.36±0.07NQO2下調(diào)組984.67±49.1215.83±0.83**

注:與野生型組和陰性對(duì)照組比較,**P<0.01

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化目前被公認(rèn)為是一種由多因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)性疾病[5]。殷亞昕等[6]報(bào)道辛伐他汀能通過(guò)降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠高遷移率族蛋白1及其基因的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng),從而減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。以往研究發(fā)現(xiàn)一種具有心血管保護(hù)作用的多酚類(lèi)化合物白藜蘆醇可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡,從而實(shí)現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[7]，且這種多酚類(lèi)化合物可與NQO2形成晶體結(jié)構(gòu)從而降低胞漿內(nèi)的NQO2水平。而利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建的NQO2沉默的K562細(xì)胞同白藜蘆醇干預(yù)的K562細(xì)胞具有類(lèi)似的抗甲萘醌毒性的特性[8-9],所以有學(xué)者認(rèn)為白藜蘆醇是通過(guò)抑制NQO2實(shí)現(xiàn)心血管保護(hù)作用的,但其具體的細(xì)胞內(nèi)作用途徑和機(jī)制尚不十分清楚。

近年來(lái)的研究顯示線(xiàn)粒體在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。線(xiàn)粒體通過(guò)釋放過(guò)量的ROS導(dǎo)致其自身的功能障礙,從而誘導(dǎo)血管炎癥的發(fā)生,動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[10]。線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用,包括caspase激活物的釋放、電子轉(zhuǎn)移功能的喪失、線(xiàn)粒體跨膜電位的降低甚至消失,以及Bcl-2等蛋白的功能變化[11]。線(xiàn)粒體跨膜電位的下降是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中較早發(fā)生的事件。因此,線(xiàn)粒體跨膜電位是常用的早期檢測(cè)細(xì)胞凋亡的指標(biāo)之一。

本研究采用以往使用的RNA干擾慢病毒載體感染RASMCs的技術(shù)實(shí)現(xiàn)下調(diào)NQO2基因及蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示與野生型及陰性對(duì)照組相比,NQO2下調(diào)組RASMCs的增殖受到明顯抑制,線(xiàn)粒體膜電位顯著下降,同時(shí)伴有細(xì)胞色素C水平的明顯升高,提示NQO2基因的下調(diào)可影響線(xiàn)粒體的正常功能,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激也與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。線(xiàn)粒體DNA突變可致線(xiàn)粒體呼吸衰竭而造成ROS的生成增加,ROS可進(jìn)一步誘導(dǎo)線(xiàn)粒體DNA的突變,引起呼吸衰竭和脂質(zhì)過(guò)氧化的形成,如此循環(huán)導(dǎo)致細(xì)胞損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)NQO2基因下調(diào)組的總SOD活性較野生型和陰性對(duì)照組有升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示NQO2基因水平與RASMCs的氧化應(yīng)激狀態(tài)有一定關(guān)系。

綜上所述,NQO2的下調(diào)可降低RASMCs線(xiàn)粒體膜電位,致細(xì)胞色素C釋放增加,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。因此,白藜蘆醇抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制與下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞的NQO2表達(dá)、影響線(xiàn)粒體功能、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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Effects of down-regulation of quinone reductase 2 on mitochondrial membrane potential in rat aortic smooth muscle cells

CAIJing-bo,JIPeng,YINHong-li,WANGLan,GUOHong-mei.

DepartmentofCardiology,JiangsuProvinceGeriatricInstiture,Nanjing210024,China

Objective To investigate the effects of down-regulation of quinone reductase 2 (NQO2) on mitochondrial membrane potential in rat aortic smooth muscle cells (RASMCs). Methods RASMCs were divided into three groups, wild group, negative control group and NQO2down-regulated group. A lentiviral vector incorporating NQO2 short interference RNA of short hairpin was transduced into RASMCs. Cell proliferation was detected by bromodeoxyuridine (BrdU) assay. Flow cytometry was used to observe mitochondrial membrane potential. The contents of superoxide dismuta (SOD) and cytochrome C were detected by using kits. Results The proliferation of RASMCs was significantly inhibited by down-regulation of NQO2. Mitochondrial membrane potential in RASMCs with lower NQO2(13.58±0.12) was obviously lower than that in wild (15.48±0.41) and negative control cells (15.96±0.52) (P<0.01). Compared with wild (9.62±0.29 ng/L) and negative control cells (9.36±0.07 ng/L), RASMCs with suppressed NQO2 had significantly higher level of cytochrome C(15.83±0.83 ng/L) (P<0.01). Conclusions This study suggests that down-regulation of NQO2 signi-ficantly suppresses RASMCs proliferation and mitochondrial membrane potential, which may be the mechanism against atherosclerosis.

mitochondrial membrane potential; rat aortic smooth muscle cells; quinone reductase 2; RNA interference; apoptosis

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2011841)

210024江蘇省南京市，江蘇省老年醫(yī)學(xué)研究所心內(nèi)科

R 543.5

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.02.008

2014-05-05)