大鼠局灶性腦缺血模型評價方法間關(guān)聯(lián)性分析

崔煦然，劉釗，張志斌，鐘菊迎

（中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心分子生物實驗室，中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心國家重點實驗室，北京 100700）

研究報告

大鼠局灶性腦缺血模型評價方法間關(guān)聯(lián)性分析

崔煦然，劉釗，張志斌，鐘菊迎*

（中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心分子生物實驗室，中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心國家重點實驗室，北京 100700）

目的分析評價線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞模型成功的三種方法之間的相關(guān)性，為評價該模型提供一種新的方法和標(biāo)準(zhǔn)。方法雄性SD大鼠共（30）只，隨機分成假手術(shù)組（n=15）、模型組（n= 15），參照Zea-Longa線栓法稍加改進制備局灶性腦缺血模型，于術(shù)前術(shù)后檢測各組大鼠腦血流變化。以大鼠腦梗死面積率為金標(biāo)準(zhǔn)，分析該標(biāo)準(zhǔn)與腦血流變化之間的相關(guān)性。結(jié)果模型大鼠腦梗死面積率與腦血流變化量呈正相關(guān)，與行為學(xué)評分高低無關(guān)。結(jié)論大鼠腦血流量變化可作為評價局灶性腦缺血模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。

腦梗死面積率；行為學(xué)評分；腦血流量；大鼠

線栓法［1］是制備大鼠局灶性腦缺血模型的常用方法。該方法無需開顱，便于操控。評價該模型成功的方法常用大鼠行為學(xué)評分［2］以及TTC染色法，但行為學(xué)評分方法具有主觀性，TTC染色法存在操作繁瑣等缺點。本實驗對Zea-Longa［2］線栓法稍加改進，制備大鼠腦缺血模型，并在此兩種評價方法的基礎(chǔ)上，監(jiān)測大鼠腦血流量變化，分析三種評價方法之間的相關(guān)性。旨在探索一種客觀、操作簡便、創(chuàng)傷小且可行的評價方法。

1 材料與方法

1.1 動物來源與分組

清潔級雄性SD大鼠30只，250 g左右［3］，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供【SCXK（京）2012—0001】。動物實驗在中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所動物房【SYXK（京）2010-0032】進行。大鼠隨機分成假手術(shù)組（n=15）、模型缺血組（n= 15）。

1.2 模型建立［4］

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備

（1）激光散斑血流監(jiān)測視頻系統(tǒng)：帕瑞醫(yī)學(xué)科技（北京）有限公司，型號PeriCam PSI。線栓：由北京沙東生物技術(shù)有限公司提供。

（2）動物準(zhǔn)備：大鼠術(shù)前自由飲食，適宜條件下飼養(yǎng)。

（3）麻醉：采用10%水合氯醛腹腔注射全身麻醉（350 mg/kg）。

1.2.2 局灶性腦缺血模型的制備

參照Zea-Longa報道的線栓法，制備大鼠左腦局灶性永久性腦缺血模型。首先麻醉大鼠，將大鼠以俯臥位固定，剪開頭皮處皮膚，剝離開筋膜，暴露出頭骨十字，利用腦血流檢測儀監(jiān)測大鼠雙側(cè)腦部血流情況，之后將大鼠以仰臥位固定，頸前部消毒，取頸正中偏右一點切口剪開皮膚并鈍性剝離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動脈

（common carotid artery，CCA），頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）和頸外動脈（external carotid artery，ECA），用動脈夾暫時阻斷CCA及ICA血流，探查頸外動脈在頸部發(fā)出第一分支處，在其遠心端（偏嘴側(cè)）約0.2 cm處用縫合線進行結(jié)扎。用6號注射器于CCA處作一小切口，將線栓從CCA插入ICA，輕輕將線栓送入顱內(nèi)，若不能順利將線栓送入顱內(nèi)，可調(diào)整線栓與ICA的角度，或更換線栓；若線栓插入過程中，線栓進入血管內(nèi)的長度小于1 cm即遇阻力，同時大鼠出現(xiàn)輕微的右側(cè)面肌抽動，則線栓誤入翼腭動脈（pterygopalatine artery，PPA），須拔線栓至 CCA處，再度調(diào)整線栓角度，重新插入。栓塞成功后，用手術(shù)線結(jié)扎CCA切口處，移去夾閉CCA的動脈夾，觀察無活動性出血后縫合切口。將大鼠以俯臥位固定，再次監(jiān)測其腦部血流變化。

1.2.3 假手術(shù)組

麻醉大鼠，首先以俯臥位固定，剪開頭皮處皮膚，剝離開筋膜，暴露出頭骨十字，利用腦血流檢測儀監(jiān)測大鼠雙側(cè)腦部血流情況，之后將大鼠以仰臥位固定，頸前部消毒，取頸正中偏右一點切口剪開皮膚并鈍性剝離皮下組織，分離出右側(cè)CCA，ICA和 ECA，之后縫合切口即可。再次監(jiān)測大鼠頭部血流變化。

1.3 行為學(xué)評分

分別于術(shù)前、術(shù)后24 h觀察大鼠行為并進行評分。參照Zea-Longa評分方法：無行為障礙的記為0分；左側(cè)前肢屈曲的記為1分；爬行時身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈的記為2分；身體向左側(cè)傾倒的記為3分；不能自主行走并伴有意識障礙的記為4分。

1.4 大鼠腦梗死面積率［5］

術(shù)后24 h，將大鼠深度麻醉，斷頭取腦，將大腦置于ˉ20℃冰箱中快速冷凍10 min，以視交叉平面為中心連續(xù)冠狀切片5張，將腦切片置于2%TTC染液中孵育約30min，梗死區(qū)域為白色，正常腦組織則被染為紅色。用數(shù)碼相機對腦切片拍照，利用IPP軟件計算腦梗死面積率。腦梗死面積率=梗死區(qū)域面積/全腦面積×100%。

1.5 大鼠腦血流量變化

腦缺血模型組和假手術(shù)組大鼠于術(shù)前和術(shù)后24 h分別監(jiān)測腦血流量變化。腦血流量變化=［正常平血流均值ˉ（腦缺血平血流均值/腦缺血24 h平血流均值）/正常平血流均值×100%］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用T檢驗的方法。數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評分

術(shù)后24h，觀察大鼠行為狀態(tài)，同時進行評分。假手術(shù)組大鼠活動正常，模型組大鼠出現(xiàn)不同癥狀的形為障礙，平均行為學(xué)評分為（2.1±0.3），與正常組比較差異有顯著性（P＜0.01）。

2.2 大鼠腦梗死面積率

圖1顯示，TTC染色結(jié)果，其中假手術(shù)組大鼠腦部無缺血部位，模型組大鼠左腦出現(xiàn)明顯的梗死灶，呈現(xiàn)白色，利用IPP軟件計算腦缺血面積率為（27.05±11.03），與模型對照組比較差異有顯著性（P＜0.01）。

2.3 大鼠腦血流量變化

術(shù)前，大鼠雙側(cè)腦血流平穩(wěn)，術(shù)后大鼠左側(cè)腦部血流量立即下降，下降明顯，右側(cè)大腦血流量基本無變化，24 h后，大鼠左腦血流量與術(shù)后相比無明顯變化，其右腦血流量基本正常。假手術(shù)組大鼠雙側(cè)腦部血流量于術(shù)后術(shù)前相比無明顯變化。具體數(shù)據(jù)見表1、圖2、圖3。

2.4 相關(guān)性分析

將術(shù)后24 h時的大鼠腦梗死面積率與腦血流變化量進行對比，腦梗死面積率與腦血流變化量呈正相關(guān)。如圖4所示。

圖1 大鼠腦切片染色圖Fig.1 Staining pattern in the rat brain slices

表1 大鼠腦血流量變化（xˉ±s，n=15）Tab.1 Changes of cerebral blood flow in the rats

圖2 大鼠雙側(cè)腦血流量值變化Fig.2 Changes of bilateral cerebral blood flow in the rats.

圖3 大鼠腦部血流變化實時監(jiān)測圖Fig.3 Real-timemonitoring of the changes of blood flow in the rat brain.

圖4 大鼠腦血流變化量與腦梗死面積率比較Fig.4 Comparison of cerebral blood flow and cerebral infarction area ratio in the rats.

3 討論

腦卒中是一種常見的急癥、重癥。Zea-Longa線栓法被廣泛用于實驗性局灶腦缺血模型的建立。對于模型成功與否的評價，普遍采用行為學(xué)評分以及TTC染色法，而對于該模型，大鼠腦血流量的變化則鮮有報道。大鼠行為學(xué)評分具有主觀性，TTC染色法雖能客觀評價模型的成功性，但卻需處死大鼠后取得結(jié)果，從而阻礙了后續(xù)實驗的進行。同時消耗了大量的樣本、試劑等。若采用大鼠腦血流量變化為評價標(biāo)準(zhǔn)，則避免浪費過多的樣本，且能實時監(jiān)測大鼠腦部變化，更具客觀性。本實驗以此為背景，制備了大鼠腦缺血模型，使用血流檢測儀實時監(jiān)測大鼠術(shù)前、術(shù)后即刻以及缺血24 h的腦部血流變化。同時以大鼠行為學(xué)評分為輔助標(biāo)準(zhǔn)，以腦梗死面積率為金標(biāo)準(zhǔn)，分析大鼠腦血流變化與腦梗死面積率間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，大鼠腦梗死面積率與血流減少量呈正相關(guān)。因此，大鼠腦血流量變化可以作為一種客觀的評價標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于缺血模型成功的評價。

［1］ Koizumi J，Yodaida Y，Nakazawa T，etal.Experimental studies of ischemic brain edema：A new experimentalmodel of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area［J］.Jpn JStroke，1986，8（1）：1ˉ8.

［2］ ZeaˉLonga E.Weinstin P.Carlson S.et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke. 1989，20（1）：84ˉ91.

［3］ 李晶，郭利平.線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的研究進展［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，27（1）：54ˉ56.

［4］ 朱繼，萬東，唐文淵.改良線栓法制備大鼠局灶腦缺血模型［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29（8）：685ˉ687.

［5］ 趙浩，李永寧，王任直，等.大鼠局灶性腦缺血模型的有效制備［J］.中國實驗動物學(xué)報，2009.17（6）：432ˉ436.

Analysis of the correlation between three evaluation methods of ratmodels of focal cerebral ischem ia/reperfusion

CUIXu-ran，LIU Zhao，ZHANG Zhi-bin，ZHONG Ju-ying
（China Academy of Traditional Chinese Medicine Experimental Center for Molecular Biology Laboratory，State Key Laboratory of Medical Research Center of Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700，China）

ObjectiveTo analyze the correlation between three evaluationmethods ofmiddle cerebral artery occlusion and focal cerebral ischemia，and to explore a new method and standard for the evaluation of the model.M ethodThirty healthy adultmale SD rats were random ly divided into a sham-operated group（n=20）and model group.According to Zea-Longa procedure，we established the diseasemodel to detect the changes in cerebral blood flow before and after surgery.The resulted cerebral infarction area was taken as gold standards.Then we analyzed the correlation between the standards and the changes in cerebral blood flow.ResultsThe changes of infarction area ratio were positively correlated with the changes of cerebral blood flow in the model rats.ConclusionsThe changes of rat cerebral blood flow can be used to evaluate whether the cerebral ischemiamodel is successful or not.

Infarct area；Behavioral score；Cerebral blood flow；Rats

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0506-04

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.012

2015-05-12

中國中醫(yī)科學(xué)院院自主課題（ZZ2012012）。

崔煦然（1988ˉ），女，碩士研究生，研究方向：中藥藥理。Email：cxrkuaile@126.com

鐘菊迎（1981ˉ），女，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥理研究。Email：zhongjuying@hotmail.com