斑馬魚消化器官發(fā)育缺陷突變體的遺傳篩選

黃超，張沖，蔣發(fā)明，王飛，阮華，黃紅輝

（淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，西南大學生命科學學院，重慶 400715）

研究報告

斑馬魚消化器官發(fā)育缺陷突變體的遺傳篩選

黃超，張沖，蔣發(fā)明，王飛，阮華*，黃紅輝*

（淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，西南大學生命科學學院，重慶 400715）

目的正向遺傳篩選斑馬魚肝臟、腸和膽囊發(fā)育缺陷突變體。方法ENU誘變野生型斑馬魚并開展經(jīng)典的F2代篩選，以lfabp為探針的全胚原位雜交、BES-H2O2-Ac熒光染料分別檢測斑馬魚早期胚胎肝臟、腸和膽囊的表型。結(jié)果在128個突變基因組中篩選獲得了源自14個F2家族的斑馬魚消化器官發(fā)育缺陷突變體品系23個，并按表型劃分為6類。結(jié)論斑馬魚肝臟、腸和膽囊的發(fā)育調(diào)控機制有相似性和差異性。

斑馬魚；消化器官；遺傳篩選；突變體

肝臟、膽囊、腸等是重要的消化器官，在食物消化、貯存、營養(yǎng)吸收、排泄和內(nèi)分泌等方面都有著重要的作用［1］。斑馬魚是常用的脊椎模式動物，它的消化器官組成結(jié)構(gòu)和發(fā)育分子機制類似于哺乳動物［2］。斑馬魚具有體外發(fā)育、胚胎透明、胚胎發(fā)育周期短、產(chǎn)卵量大等優(yōu)點，突顯其在遺傳學研究上的優(yōu)勢，也使得斑馬魚成為目前唯一適合于大規(guī)模遺傳篩選的脊椎模式動物［3］。構(gòu)建斑馬魚消化器官發(fā)育缺陷突變體有助于研究消化器官發(fā)育的分子機制，并可能用于人類相關先天性疾病的研究。本課題通過在斑馬魚中進行無基因差別的正向遺傳篩選，獲得不同消化器官發(fā)育缺陷的突變體，為后續(xù)消化器官發(fā)育分子機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

斑馬魚（Danio rerio），品系AB Tüebingen，用于突變體遺傳誘變及傳代。

1.1.2 實驗試劑

多聚甲醛、氯化鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸鈉、氯化鎂、檸檬酸、去離子甲酰胺（上海生工生物工程股份有限公司）；PTU（1-phenyl-2-thiourea）、 ENU （N-ethyl-N-nitrosourea）、 Tris（pH 9.5）、蛋白酶K、BSA、NBT（nitrotetrazolium blue chloride）、BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）、肝素、tRNA（Sigma）；BES-H2O2-Ac過氧化氫熒光染料（日本和光純藥工業(yè)株式會社）。

1.1.3 實驗器材

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技發(fā)展有限公司）；熒光體視顯微鏡（Zeiss SteREO Discovery V20）；全自動熒光正置顯微鏡（Zeiss Axiolmage Z2）；移液器（Gilson 10μL、20μL、100μL、200μL、1 mL）；恒溫培養(yǎng)箱（MemmentINE800）；盤旋混合儀（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司KB-3-D）；分子雜交箱（UVP HL-2000 hybrilinker hybridization Oven/UV cross linker）；pH計及精密電子天平（Mettler Toledo）；圓周式搖床（GFL 3005型）；24孔細胞培養(yǎng)皿（Costar）。

1.2 方法

1.2.1 胚胎收集及處理

斑馬魚交配產(chǎn)生的受精卵收集于0.03%的海鹽水中，并于28℃恒溫箱飼養(yǎng)。胚胎的發(fā)育階段依據(jù)已有報道確定［4］。在胚胎12 hpf（hours post-fertilization）起用0.03%PTU處理抑制色素形成，并在3.5 dpf（days post-fertilization）和5dpf時收集用于實驗的胚胎。

1.2.2 全胚胎原位雜交（whole-mount in situ hybridization，WISH）

lfabp探針合成與全胚胎原位雜交實驗依據(jù)已有報道進行［5］。3.5 dpf胚胎用蛋白酶K（1：1000稀釋）在37℃消化26 min。反義RNA探針用地高辛標記。NBT/BCIP顯色時，室溫閉光0.5～1 h即有明顯信號。

1.2.3 BES-H2O2-Ac（DCFH-DA）熒光染色

BES-H2O2-Ac（DCFH-DA）可用于檢測生理過程中產(chǎn)生的細胞源性活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）如O2ˉ，H2O2，HO˙等，斑馬魚胚胎發(fā)育過程中腸和膽囊可產(chǎn)生H2O2，可被BES-H2O2-Ac（DCFH-DA）標記［6］。收集的5 dpf斑馬魚胚胎放入24孔細胞培養(yǎng)盒中，并換上新的0.03%的海鹽水。每孔之中加入1μL BES-H2O2-Ac熒光染料（1mg/ L，溶于DMSO），使稀釋度約為1∶10 000，輕輕晃動，使染液迅速分散開，然后將培養(yǎng)盒放入28℃恒溫箱中1～2 h后取出，在熒光顯微鏡下觀察腸和膽囊的形態(tài)發(fā)育狀況。

1.2.4 篩選過程及表型分類

用ENU處理野生成年雄性斑馬魚若干，存活的雄魚稱為F0，與野生型雜交產(chǎn)生F1代。F2家族由來自不同F(xiàn)0的F1魚交配產(chǎn)生。將來自同一F2家族的斑馬魚隨機交配以獲取F3子代，利用1.2.2及1.2.3中所述方法進行實驗，若F3子代中1/4左右的個體表現(xiàn)出相同的缺陷表型，則其F2父母可被認定為攜帶隱性突變的雜合突變體。將F2雜合突變體與野生型雜交傳代，產(chǎn)生的后代稱為F3，以同樣的方法利用F4胚胎來確定F3雜合突變體。最終確定的F3突變體，將會依據(jù)其表型特征被分為幾種不同的類別［7］。

2 結(jié)果

2.1 FNU誘變與F2家族的建立

用ENU處理30條約6月齡期健康雄魚，9條F0存活，將F0與野生型雌魚雜交產(chǎn)生子代，即F1代（每條F1代表一個突變基因組），保留F0第二次與第三次交配產(chǎn)生的子代飼養(yǎng)至成魚，可保證F1攜帶較多突變，并降低來自于同一精母細胞帶有相同突變的精子都產(chǎn)生子代的概率，每條F0生產(chǎn)約100條F1，共計958條，然后將不同F(xiàn)0產(chǎn)生的F1交配產(chǎn)生F2家族。

2.2 F2代篩選與突變體的傳代

將來自同一F2家族的魚隨機交配，檢測產(chǎn)生的F3胚胎的表型，并根據(jù)孟德爾遺傳定律判斷親本是否為候選突變體。我們從64個F2家族中的204對魚中，篩選得到了65對候選突變體，并對表型不確定的候選突變體做了二次鑒定，排除了12對非突變體。有4對因表型非特異性被舍棄，另有9對在篩選中丟失或死亡而無法鑒定。最終，來自23個F2家族的32對突變體與野生型進行傳代，產(chǎn)生了F3家族，見表1。因為F2家族是由不同的F1相互雜交產(chǎn)生的，所以每個F2家族突變體代表兩個突變基因組，故此次篩選的規(guī)模為128個突變基因組。

2.3 F3代建立與篩選

F3代家族篩選與F2代篩選類似，將來自同一F3家族的斑馬魚雌雄個體之間隨機交配以產(chǎn)生F4胚胎，根據(jù)F4胚胎表型比例確定F3是否為雜合突變體。在總共32個F3家族中，其中有一個家族（L39-4）因全是雌魚無法配對而被舍棄。其余31個F3家族共成功交配251對斑馬魚，從中篩選得到了40對突變體。二次鑒定之后，18個F3家族的表型是可遺傳的。最終，依據(jù)表型、初始F2家族，保留下來的34對突變體歸為23個F3突變品系，見表2。

2.4 F3突變體的表型分類

F3篩選結(jié)束之后，根據(jù)突變品系的不同表型特征，將其分為六類，見表3和表4，代表品系展示見圖1。第I類為“腸特異性缺陷突變體”，這類突變體的腸具有較大程度缺陷，基本表現(xiàn)為腸彎曲窄細或者幾乎無染料熒光，但是肝臟和膽囊都較為正常。第II類為“肝臟特異性缺陷突變體”，其腸和膽囊較為正常，而肝臟缺陷較為嚴重，通常表現(xiàn)為無肝臟和肝臟偏小的表型。第III類為“膽囊特異性缺陷突變體”，其肝臟和腸并無明顯缺陷，但是膽囊呈現(xiàn)出偏小或者缺失的性狀。第IV類為“腸和膽囊共同缺陷突變體”，該類突變體中肝臟并沒有出現(xiàn)發(fā)育缺陷但是腸、膽囊染色均出現(xiàn)了缺陷表型。第V類為“肝臟和膽囊共同缺陷突變體”，其肝臟和膽囊都出現(xiàn)了發(fā)育缺陷但是腸染色卻是正常的，通常表現(xiàn)為肝臟偏小和膽囊偏小的表型。第VI類為“肝臟、腸和膽囊共同缺陷突變體”，lfabp和BES-H2O2-Ac染色結(jié)果都顯示肝臟、腸和膽囊存在明顯的發(fā)育缺陷。

表1 F2代篩選結(jié)果Tab.1 Results of the F2 generation screening

表2 F3代篩選結(jié)果Tab.2 Results of the F3 generation screening

表3 F3代突變體的表型分類Tab.3 Classification of the F3 mutant phenotypes

注：膽囊（星號），腸（白色箭頭），肝臟（黑色箭頭），B、D、F、H、I、L、N、P為對照組，A、C、E、G、J、K、M、O為突變體，A、B、E、F、G、H、M、N為側(cè)面觀，C、D、K、L、O、P為背側(cè)觀，I、J為腹側(cè)觀。類型I.腸特異性缺陷突變體（L34A，A&B）；類型II.肝臟特異性缺陷突變體（V15F，C&D）；類型III.膽囊特異性缺陷突變體（V25A，E&F）；類型IV.腸和膽囊共同缺陷突變體（V15D，G&H）；類型V.肝臟和膽囊共同缺陷突變體（L86A，I～L）；類型VI.肝臟、腸和膽囊共同缺陷突變體（L63A，M～P）。圖1 6類突變體品系代表示意圖Note.The gallbladder（asterisk），intestine（white arrowhead），liver（black arrowhead）.B，D，F(xiàn)，H，I，L，N，P are siblings.A，C，E，G，J，K，M，O are mutants.A，B，E，F(xiàn)，G，H，M，N are lateral views.C，D，K，L，O，P are dorsal views.I，Jare ventral views.Type I.The intestine specific mutant（L34A，A&B）；Type II.The liver specific mutant（V15F，C&D）；Type III.The gall bladder specific mutant（V25A，E&F）；Type IV.The intestine and gall bladdermutant（V15D，G&H）；Type V.The liver and gall bladder mutant（L86A，I～L）；Type VI.The liver，intestine and gall bladder mutant（L63A，M～P）.Fig.1 Six groups of representativemutant lines

表4 突變體品系匯總Tab.4 Summary of themutant lines

3 討論

3.1 遺傳篩選的結(jié)果分析

雖然正向遺傳篩選斑馬魚發(fā)育缺陷突變體的研究已廣泛開展，但是利用ENU誘變同時篩選多個消化器官發(fā)育缺陷突變體的案例卻并不多。本次篩選工作著重關注肝臟、膽囊以及腸3個消化器官的發(fā)育缺陷，在一次篩選中獲得多種突變體，提高了突變?nèi)后w的利用率，并可獲得單個消化器官特異性缺陷的突變體。

ENU篩選過程中的突變效率一般為0.2%左右［8］，本次研究中并沒有檢測突變效率，但是在128個突變基因組的篩選中，最終獲得了突變品系23個，可見本次突變和篩選的效率都是比較高。這些突變體表型多樣化，說明調(diào)控不同消化器官發(fā)育的基因是不同的，但也發(fā)現(xiàn)不同突變體表型之間有交叉。從23個突變品系分類來看，有約40%的突變品系具有2種及以上的發(fā)育缺陷表型。說明這些消化器官在各自發(fā)育過程中的某些調(diào)控因子之間存在相似性，也暗示了它們在分子發(fā)育調(diào)控過程中存在著必然的聯(lián)系。

3.2 篩選過程中存在的不足和限制性因素

ENU篩選工作量大，空間和人手都是限制性因素。此次篩選規(guī)模并不大，為了彌補這一缺陷，我們采用F1代雌雄個體進行交配而非傳統(tǒng)的F1外交生產(chǎn)F2家族的策略，提高了篩選效率，但也導致了突變體的遺傳背景更為雜亂，獲得的突變體需外交傳代稀釋遺傳背景。

我們的篩選獲得了23個突變品系，將利用圖位克隆技術(shù)鑒定突變基因，并針對突變體表型和突變基因進一步探究，有望對斑馬魚乃至其他脊椎動物消化器官發(fā)育的分子機制有進一步的理解。

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Genetic screening of zebrafish mutants w ith developmental defects in the digestive organs

HUANG Chao，ZHANG Chong，JIANG Fa-ming，WANG Fei，RUAN Hua*，HUANG Hong-hui*
（Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development，Ministry of Education，State Key Laboratory Breeding Base of Eco-Environments and Bio-Resources of the Three Gorges Reservoir Region，School of Life Sciences，Southwest University，Beibei，Chongqing 400715，China）

ObjectiveTo obtain zebrafish mutants with developmental defects in digestive organs from a forward genetic screening.M ethodsENUmutagenesis and a classical F2 genetic screening were performed.RNA wholemount insitu hybridization using lfabp as probe and BES-H2O2-Ac staining was applied to examine the liver，intestine and gall bladder phenotype in zebrafish embryos.ResultsWe harvested 23 mutant lineswith developmental defects in digestive organs（originated from 14 F2 families）after screening 128 mutagenized genomes.These mutants were classified into six groups according to their phenotypes.ConclusionsThe liver，intestine and gall bladder share and differ in their developmental molecularmechanisms in zebrafish.

Zebrafish；Digestive organs；Genetic screening；Mutants

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0441-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.001

2015-06-22

國家自然科學基金面上項目（31471365）；西南大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費（XDJK2014A013、2362014xk02）。

黃超（1990ˉ），男，碩士，研究方向：發(fā)育生物學E-mail：zjhc2007@126.com

黃紅輝（1974ˉ），男，博士，教授，研究方向：發(fā)育生物學E-mail：honghuih@126.com；

阮華（1974ˉ），女，博士，教授，研究方向：發(fā)育生物學，E-mail：ruanhua23@126.com