高通量結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達(dá)篩選平臺(tái)的構(gòu)建與應(yīng)用

許靜 任百光 程海麗 劉懷鈺 魏文豐 鄧?yán)势?封勝雪 畢利軍

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·論著·

高通量結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達(dá)篩選平臺(tái)的構(gòu)建與應(yīng)用

許靜 任百光 程海麗 劉懷鈺 魏文豐 鄧?yán)势?封勝雪 畢利軍

目的 為了改變結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究由于受結(jié)核分枝桿菌蛋白難以可溶性表達(dá)和純化的影響而進(jìn)展緩慢的問題。方法 將多個(gè)能促進(jìn)可溶性表達(dá)的蛋白標(biāo)簽與高通量的Gateway克隆技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶性表達(dá)快速通量的篩選平臺(tái)。挑選46個(gè)不同分子量且已知以包涵體形式表達(dá)或者不表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌蛋白的基因，分別克隆到帶有N-末端的氮源利用物質(zhì)A(N utilization substance A, NusA)、小分子泛素樣修飾蛋白 (small ubiquitin-like modifier-1, SUMO)、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein，MBP)、硫氧還蛋白(thioredoxin A, TrxA)、?；d體蛋白(acyl carrier protein, ACP)五種蛋白標(biāo)簽基因的載體上，進(jìn)行融合表達(dá)，分析比較各標(biāo)簽促進(jìn)可溶性表達(dá)的效果。結(jié)果 融合NusA標(biāo)簽后，19個(gè)蛋白以可溶性形式表達(dá)，占總樣本的41%(19/46)；同時(shí)融合SUMO、MBP、TrxA、ACP標(biāo)簽后，可溶性表達(dá)的蛋白也分別達(dá)到總樣本數(shù)的22%(10/46)、26%(12/46)、26%(12/46)、22%(10/46)。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶性表達(dá)快速通量篩選平臺(tái)的建立，實(shí)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌重組蛋白可溶性表達(dá)的快速通量篩選，為更進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌蛋白、特別是重要藥物靶標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能創(chuàng)造了條件。

結(jié)核分枝桿菌； 重組融合蛋白質(zhì)類； 高通量篩選分析

結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理研究和關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與功能研究都需要重組表達(dá)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白或者藥物靶標(biāo)蛋白。在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室將結(jié)核分枝桿菌蛋白重組到釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)幾乎所有蛋白都能可溶表達(dá)，但是表達(dá)量偏低，無法滿足多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求[1]。大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)以其背景清晰、生長(zhǎng)快速、表達(dá)量高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，仍為最常用的表達(dá)系統(tǒng)[2, 3]，然而結(jié)核分枝桿菌重組蛋白以大腸桿菌為異源表達(dá)的宿主時(shí)，只有少量的蛋白能實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，大多數(shù)蛋白不表達(dá)或者是以不可溶的包涵體形式表達(dá)。包涵體蛋白雖然可以通過變性復(fù)性獲得一定比例的可溶蛋白[4-6]，但是這些操作很大程度上會(huì)影響目的蛋白的活性從而影響后續(xù)的功能研究。

融合標(biāo)簽與目的蛋白融合表達(dá)時(shí)可增加重組蛋白的表達(dá)量或增強(qiáng)重組蛋白的可溶性[2, 7-8]。氮源利用物質(zhì)A (N utilization substance A, NusA)、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein，MBP)、硫氧還蛋白(thioredoxin A, TrxA)是發(fā)展較早的融合標(biāo)簽，研究表明MBP具有很好的促溶效果，并能幫助融合蛋白正確折疊[9-10]；NusA與MBP提高可溶性表達(dá)能力相當(dāng)[11]，有些研究認(rèn)為TrxA也具有很好的提高重組蛋白可溶性表達(dá)的能力[12-13]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)小分子泛素樣修飾蛋白(Small ubiquitin-like modifier-1,SUMO)能夠促進(jìn)蛋白正確折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而提高蛋白可溶性[14-17]。?；d體蛋白(acyl carrier protein, ACP)極性氨基酸含量很高，本身可溶性非常高，能在一定程度上促進(jìn)重組蛋白可溶表達(dá)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

盡管現(xiàn)在融合標(biāo)簽技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，但是目前還沒有將融合標(biāo)簽用于結(jié)核分枝桿菌重組蛋白表達(dá)的報(bào)道，而且缺少一個(gè)高通量的平臺(tái)能夠快速的篩選多個(gè)不同融合標(biāo)簽的促溶效果。為找到能更好的表達(dá)結(jié)核分枝桿菌蛋白的重組表達(dá)系統(tǒng)，本研究選取上述5個(gè)融合標(biāo)簽，分別與46個(gè)不同分子量且已知以包涵體形式表達(dá)或者不表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌蛋白融合表達(dá)，比較這些融合標(biāo)簽促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白可溶性表達(dá)的效果。 另一方面，本研究構(gòu)建的載體引入了Gateway[18-19]反應(yīng)位點(diǎn)附著點(diǎn)(attachment site，att) R(attR)，克服了克隆位點(diǎn)不一致、重組蛋白性質(zhì)不同等原因不能高通量表達(dá)、純化異源蛋白的困難，實(shí)現(xiàn)了通量、高效的結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶性表達(dá)篩選。本研究中所有結(jié)核分枝桿菌蛋白基因均可采用Gateway克隆技術(shù)高通量地重組到構(gòu)建的載體中，實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌蛋白基因高效克隆。此外，除MBP融合蛋白外，其余融合蛋白的N端均帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽 (6 His)，因此可以通過鎳離子金屬螯合親和層析法(Ni-NTA)進(jìn)行純化，實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的高效表達(dá)篩選。

材料和方法

一、材料

1.質(zhì)粒和菌株：Gateway pDEST17 vector(簡(jiǎn)稱“pDEST17”)購(gòu)自Thermo scientific公司；pET32a通用質(zhì)粒、pET50b通用質(zhì)粒購(gòu)自Novagen公司；實(shí)驗(yàn)中所使用的入門(entry)克隆菌為美國(guó)克雷格·文特爾研究所(J. Craig Venter Institute) 下設(shè)的病原體功能基因組學(xué)資源中心(Pathogen Functional Genomics Resource Center，PFGRC)免費(fèi)提供；Gateway pET32a-ACP vector(簡(jiǎn)稱“pET32a-ACP”)、PKMV-SUMO 質(zhì)粒為北京六合華大基因科技有限公司構(gòu)建；Rosetta(DE3)、E.coilDH5α、E.coilDB3.1菌株購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

2.主要試劑：限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs(NEB)公司； Gateway?LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix購(gòu)自美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)公司；BugBuster購(gòu)自德國(guó)默克公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR回收試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)； Ni-NTA樹脂購(gòu)自德國(guó)默克公司；直鏈淀粉樹脂(amylose resin)購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs(NEB)公司；其他分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

3.DNA測(cè)序：寡核苷酸引物的合成、重組質(zhì)粒的測(cè)序由華大基因科技股份有限公司廣州分公司完成。

二、方法

1.融合標(biāo)簽載體構(gòu)建：以pDEST17為模板，attR-p1、attR-p2為引物(表1)，擴(kuò)增得到1730 bp的Gateway反應(yīng)位點(diǎn)序列，經(jīng)HindⅢ、SacⅠ酶切后，連接入同樣酶切的pET50b載體中，轉(zhuǎn)化E.coilDB3.1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得到重組載體Gateway pET50b vector；隨后經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ切出3467 bp的NusA+Gateway反應(yīng)位點(diǎn)序列，連接入同樣酶切的pET32a通用質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化E.coilDB3.1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得到融合標(biāo)簽載體Gateway pET32a-NusA vector(簡(jiǎn)稱“pET32a-NusA”)。

提取載體pET32a-NusA，用NdeⅠ和SacⅡ酶切回收大片段，和帶有相同酶切位點(diǎn)的組氨酸標(biāo)簽(His-tag)編碼基因連接，His-tag編碼基因雙鏈由兩條寡核苷酸單鏈退火形成，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilDB3.1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得到融合標(biāo)簽載體Gateway pET32a vector(簡(jiǎn)稱“pET32a”)。

編碼his-tag的寡核苷酸單鏈為：5′-TATGGGCAGCAGCCATCACCACCATCACCATTCT-AGTTCCGC-3′，5′-GGAACTAGAATGGTGATGGTGGTGATGGCTGCTGCCCA-3′

PKMV-SUMO 質(zhì)粒用NdeⅠ和SacⅡ切出376 bp的SUMO片段，連接入同樣酶切的pET32a-NusA載體中，轉(zhuǎn)化E.coilDB 3.1感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)篩選陽性克隆接種于5 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)的溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，取菌液送華大基因科技股份有限公司廣州分公司測(cè)序，經(jīng)驗(yàn)證得到融合標(biāo)簽載體Gateway pET32a-SUMO vector(簡(jiǎn)稱“pET32a-SUMO”)。

以pET32a通用質(zhì)粒為模板，TrxA-p1、TrxA-p2(表1)為引物擴(kuò)增得到328 bp的TrxA片段，經(jīng)NdeⅠ和SpeⅠ酶切后，連接入同樣酶切的pET32a-ACP載體中，同上轉(zhuǎn)化E.coilDB3.1感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆接種LB液體培養(yǎng)基，取菌液經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得到融合標(biāo)簽載體Gateway pET32a-TrxA vector(簡(jiǎn)稱“pET32a-TrxA”)。

以pMAL-c2x質(zhì)粒為模板，MBP-p1、MBP-p2(表1)為引物擴(kuò)增得到1102 bp的MBP片段，經(jīng)NdeⅠ和SacⅡ酶切后，連接入同樣酶切的pET32a-ACP載體中，同上轉(zhuǎn)化E.coilDB3.1感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆接種LB液體培養(yǎng)基，取菌液經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得到融合標(biāo)簽載體Gateway pET32a-MBP vector(簡(jiǎn)稱“pET32a-MBP”)。

2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建：在保證蛋白分子量大小平均分布的前提下，隨機(jī)選取46個(gè)結(jié)核分枝桿菌蛋白，其中4個(gè)可溶表達(dá)蛋白作為對(duì)照，其余42個(gè)蛋白均為不表達(dá)或包涵體表達(dá)(表2)。培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的entry克隆菌，提取entry克隆質(zhì)粒，然后按entry克隆質(zhì)粒∶LR反應(yīng)酶∶融合標(biāo)簽載體質(zhì)粒=3∶1∶1的比例混合，25 ℃過夜，轉(zhuǎn)化E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選單克隆接種于1.2 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。小量提取質(zhì)粒DNA，BsrGⅠ酶切驗(yàn)證后測(cè)序驗(yàn)證。

3.融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析：將經(jīng)酶切測(cè)序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(表達(dá)菌)，挑選單克隆接種于含氨芐青霉素(100 μg/ml)和氯霉素(30 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。按5∶100的接種量轉(zhuǎn)接于5 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)和氯霉素(30 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)約1.5 h至A600值=0.6～0.8，加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.4 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。收集菌體采用BugBuster裂解，離心后沉淀用與1%+二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)重懸制樣，上清取部分制樣，余下上清制取柱結(jié)合樣品。采用Amylose分離MBP融合蛋白，用10倍柱體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L)平衡Amylose樹脂，加入余下上清4 ℃結(jié)合2 h，然后用PBS緩沖液洗滌樹脂3次，最后加入一定量洗脫緩沖液(NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L，麥芽糖20 mmol/L)洗脫蛋白制樣。采用Ni-NTA樹脂純化His-tag融合蛋白，同上菌體裂解制樣后剩下的上清加入用裂解緩沖液(20 mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) ，500 mmol/L NaCl，10%甘油，pH 8.0)洗滌和平衡后的樹脂，4 ℃結(jié)合30 min，然后用洗滌緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑，10%甘油，pH 8.0]洗滌樹脂3次，最后加入一定量洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,500 mmol/L 咪唑，10%甘油，pH 8.0)洗脫蛋白制樣。上清、沉淀、柱結(jié)合樣品通過10% N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)(10%Tricine-SDS-PAGE)進(jìn)行分析。

表1 本研究所使用的寡核苷酸引物

注 酶切位點(diǎn)用下劃線表示

表2 本研究所選的結(jié)核分枝桿菌蛋白

注 表中蛋白信息來自TubercuList 網(wǎng)站 (http://tuberculist.epfl.ch/)。IB：包涵體表達(dá)；S：可溶表達(dá)；N：不表達(dá)

結(jié) 果

一、融合標(biāo)簽載體的構(gòu)建

以pDEST17為模板PCR擴(kuò)增Gateway反應(yīng)位點(diǎn)序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期大小相符合。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明Gateway反應(yīng)位點(diǎn)序列全長(zhǎng)1730 bp，完全正確。重組載體Gateway pET50b vector 用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期大小相符合。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明NusA+Gateway反應(yīng)位點(diǎn)序列全長(zhǎng)3467 bp，完全正確；表明重組融合標(biāo)簽載體pET32a-NusA構(gòu)建成功。

由2條寡核苷酸單鏈退火形成的his-tag編碼基因雙鏈用NdeⅠ、SacⅡ雙酶切，連接入同樣酶切的pET32a-NusA載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明重組載體pET32a無堿基缺失、插入等突變現(xiàn)象，表明重組載體pET32a構(gòu)建成功。

PKMV-SUMO 質(zhì)粒用NdeⅠ和SacⅡ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期大小相符合。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明SUMO 標(biāo)簽全長(zhǎng)376 bp，完全正確；表明重組融合標(biāo)簽載體pET32a-SUMO構(gòu)建成功。

pET32a通用質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增TrxA片段、以pMAL-c2x質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增MBP片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期大小相符合。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明TrxA標(biāo)簽全長(zhǎng)328 bp、MBP標(biāo)簽全長(zhǎng)1102 bp，完全正確；表明重組融合標(biāo)簽載體pET32a-TrxA、 pET32a-MBP構(gòu)建成功。

二、重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

46個(gè)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白對(duì)應(yīng)entry克隆質(zhì)粒經(jīng)Gateway反應(yīng)后，得到相應(yīng)重組蛋白表達(dá)載體；經(jīng)BsrGⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)，表明均在對(duì)應(yīng)目的基因大小位置有明顯的特異性條帶，酶切驗(yàn)證正確；克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因全長(zhǎng)完全正確，46個(gè)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功。

三、重組蛋白表達(dá)檢測(cè)

結(jié)核分枝桿菌重組蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)化Rosetta，經(jīng)0.4 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)核分枝桿菌重組蛋白表達(dá)情況。與未融合標(biāo)簽的菌株相比，5種蛋白融合標(biāo)簽均可促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在E.coli中的可溶表達(dá)，然而促溶效果卻有明顯差異(表3)。

從46個(gè)重組蛋白總體表達(dá)情況來看(表4)，重組蛋白可溶表達(dá)數(shù)量占總樣本數(shù)的比例均有所提高。其中NusA標(biāo)簽融合蛋白可溶表達(dá)數(shù)量占總樣本數(shù)的比例最高[41%(24/46)，融合蛋白可溶表達(dá)數(shù)量/總樣本數(shù)]；MBP、TrxA標(biāo)簽也有一定促溶效果，其融合蛋白數(shù)量占總樣本數(shù)的比例均為26%(12/46)融合蛋白可溶表達(dá)數(shù)量/總樣本數(shù))；ACP、SUMO標(biāo)簽促溶效果最差，但是融合蛋白可溶表達(dá)數(shù)量占總樣本數(shù)的比例也均達(dá)到22%(10/46,融合蛋白可溶表達(dá)數(shù)量/總樣本數(shù))。

表3 融合不同標(biāo)簽后各蛋白的表達(dá)情況

續(xù)表3

注 IB：包涵體表達(dá)；S：可溶表達(dá)；N：不表達(dá)

表4 各種表達(dá)情況在融合不同標(biāo)簽后結(jié)核分枝桿菌重組蛋白中的表達(dá)(單位：個(gè))

注 包涵體：只在沉淀樣品電泳圖中可看到目的蛋白特異性條帶；可溶表達(dá)：在上清樣品或者柱結(jié)合樣品電泳圖中可看到目的蛋白特異性條帶；不表達(dá)：在上清、沉淀和柱結(jié)合樣品電泳圖中均未看到目的蛋白特異性條帶

從促溶效果分析(表5)，NusA蛋白融合標(biāo)簽促溶效果最好，無論是促進(jìn)包涵體蛋白可溶表達(dá)，還是促進(jìn)不表達(dá)蛋白可溶表達(dá)，NusA蛋白融合標(biāo)簽都有明顯優(yōu)于其他標(biāo)簽的效果。雖然5種蛋白融合標(biāo)簽均能促進(jìn)某些結(jié)核分枝桿菌重組蛋白可溶表達(dá)，如圖1 A中Rv2299c五種標(biāo)簽融合蛋白均有一定量的可溶表達(dá)；然而，有些蛋白只有融合了NusA蛋白融合標(biāo)簽后才能可溶表達(dá)，如圖1 A中的Rv3509c及圖1 B中的Rv0851c、Rv0315 和 Rv0774c，融合其余4種標(biāo)簽均未見明顯的可溶表達(dá)。此外，融合ACP、SUMO、MBP或TrxA標(biāo)簽中任何一個(gè)后能可溶表達(dá)的蛋白在融合了NusA標(biāo)簽后也能可溶表達(dá)，在融合了NusA標(biāo)簽后不表達(dá)或者包涵體表達(dá)的蛋白在ACP、SUMO、MBP或TrxA標(biāo)簽后依然不能可溶表達(dá)。

表5 包涵體表達(dá)或不表達(dá)蛋白在融合各標(biāo)簽后的可溶表達(dá)的數(shù)量(單位：個(gè))

注 包涵體：只在沉淀樣品電泳圖中可看到目的蛋白特異性條帶；可溶表達(dá)：在上清樣品或者柱結(jié)合樣品電泳圖中可看到目的蛋白特異性條帶；不表達(dá)：在上清、沉淀和柱結(jié)合樣品電泳圖中均未看到目的蛋白特異性條帶

討 論

融合標(biāo)簽技術(shù)是近年來興起的一項(xiàng)重組DNA技術(shù)，在重組蛋白的純化、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、幫助重組蛋白正確折疊、提高重組蛋白的可溶性及穩(wěn)定性等方面有很大的應(yīng)用價(jià)值[2, 7-8]。然而雖然融合標(biāo)簽已經(jīng)廣泛應(yīng)用于促進(jìn)蛋白的可溶表達(dá)，但是目前還沒用將融合標(biāo)簽用于結(jié)核分枝桿菌蛋白表達(dá)的報(bào)道。

結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌，結(jié)核病是困擾全球的疾病。為有效地預(yù)防和治療這種疾病，我們需要對(duì)該病原體的基本生物學(xué)和發(fā)病機(jī)理做更進(jìn)一步的研究。然而結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理研究和關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與功能研究都需要大量可溶的、有功能活性的蛋白。筆者前期研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌蛋白能在釀酒酵母中可溶表達(dá)，但是表達(dá)量不足以滿足很多實(shí)驗(yàn)的要求。結(jié)核分枝桿菌蛋白在E.coli中難以可溶表達(dá)的具體原因還不清楚，可能是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌蛋白編碼基因的GC含量較高，其密碼子偏好性與E.coli有明顯差異[20]；此外某些結(jié)核分枝桿菌蛋白存在翻譯后修飾也可能是其在E.coli中難以可溶表達(dá)的原因之一。

通過本研究的比較分析，筆者可以推測(cè)出這5種常用促溶標(biāo)簽中哪種標(biāo)簽更適合用來促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌蛋白的可溶表達(dá)。雖然5種融合標(biāo)簽均可促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在E.coli中可溶表達(dá)，但是NusA融合標(biāo)簽效果明顯優(yōu)于其他融合標(biāo)簽。其余4種標(biāo)簽雖然也能在一定程度上促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌蛋白的表達(dá)，但是重組蛋白多數(shù)還是以包涵體形式表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，融合標(biāo)簽?zāi)艽龠M(jìn)結(jié)核分枝桿菌蛋白在E.coli中可溶表達(dá)，但是具體的促溶機(jī)制還不清楚。NusA標(biāo)簽?zāi)艽龠M(jìn)蛋白可溶表達(dá)可能與NusA標(biāo)簽本身溶解度和生物活性有關(guān)。NusA標(biāo)簽本身表達(dá)量大且具有高度可溶性，可帶動(dòng)融合的靶蛋白可溶表達(dá)；此外，NusA可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄中止，從而減緩翻譯速度，為蛋白折疊提供更充足的時(shí)間[2]。

本研究中，常用的融合標(biāo)簽MBP及SUMO、TrxA促溶效果均沒有NusA融合標(biāo)簽好。一般來說MBP標(biāo)簽無論是融合在靶蛋白N-末端還是C-末端，均可促進(jìn)靶蛋白可溶表達(dá)；然而有研究顯示MBP標(biāo)簽融合在靶蛋白N-末端會(huì)降低翻譯效率[15]，這可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)中MBP標(biāo)簽促溶效果沒有NusA標(biāo)簽好的原因。大多數(shù)情況下SUMO、TrxA融合標(biāo)簽有很好的促溶效果，但有些蛋白還是以包涵體形式表達(dá)或不表達(dá)，其原因尚不清楚；有一部分可能是因?yàn)镾UMO、TrxA融合標(biāo)簽本身分子量小，靶蛋白mRNA與小標(biāo)簽mRNA形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)干擾核糖體的結(jié)合，從而阻礙翻譯的有效進(jìn)行[8]。

蛋白融合標(biāo)簽可顯著提高結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在E.coli中可溶表達(dá)，為結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的分離純化提供了更多選擇。然而蛋白融合標(biāo)簽并不能完全解決結(jié)核桿菌蛋白可溶表達(dá)的難題，在融合了這些標(biāo)簽后還是有一定比例的蛋白不表達(dá)或者不可溶，但是融合標(biāo)簽只是促進(jìn)重組蛋白可溶表達(dá)的方法之一。在另一項(xiàng)研究中(未發(fā)表數(shù)據(jù))，筆者發(fā)現(xiàn)密碼子偏好性也會(huì)影響結(jié)核分枝桿菌蛋白的表達(dá)；密碼子優(yōu)化可以明顯促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌蛋白的表達(dá)，但是價(jià)格昂貴不適合通量操作。mRNA穩(wěn)定性和培養(yǎng)條件等也會(huì)影響重組蛋白的表達(dá)[21]，在后續(xù)工作中還可以嘗試更多方法提高結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的可溶表達(dá)量，為結(jié)核分枝桿菌蛋白的研究提供方便，促進(jìn)研究的深入開展。

志謝 美國(guó)克雷格·文特爾研究所病原體功能基因組學(xué)資源中心給本研究免費(fèi)提供了entry克隆菌，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所Joy Fleming博士和侯劍博士對(duì)文稿進(jìn)行了編輯整理

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(本文編輯：薛愛華)

Construction and application of a high throughput screening platform for soluble expression ofMycobacteriumtuberculosisproteins

XUJing*,RENBai-guang,CHENGHai-li,LIUHuai-yu,WEIWen-feng,DENGLang-ping,FENGSheng-xue,BILi-jun.

*SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325005,China

Correspondingauthor:BILi-jun，Email：blj@ibp.ac.cn

Objective To solve the problem that the progress in the study ofMycobacteriumtuberculosisprotein structure and function is slow asM.tuberculosisproteins are difficult to express and purify in soluble form. Methods We developed a high-throughput screening platform for the soluble expression ofM.tuberculosisproteins in Escherichia coli by combining high-throughput Gateway cloning with the use of multiple fusion tags. We randomly selected 46 genes forM.tuberculosisproteins of different molecular weights which have been difficult to purify as they are either not expressed or are expressed in inclusion bodies and fused them to the C-terminals of the N utilization substance A (NusA), small ubiquitin-like modifier-1 (SUMO), maltose-binding protein (MBP), thioredoxin A (TrxA), and acyl carrier protein (ACP) tags. These constructs were then expressed inE.coliand evaluated for expression and solubility. Results As expected, the fusion tags varied in their ability to produce solubleM.tuberculosisproteins. NusA fusion enhanced expression and solubility of recombinant proteins most dramatically; 19 proteins (41%，19/46) fused with the NusA tag were expressed in soluble form, while 22%(10/46), 26%(12/46), 26%(12/46) and 22%(10/46)of proteins fused with the SUMO, MBP, TrxA, and ACP tags, respectively, were solubly expressed. Conclusion The development of high-throughput screening platform for the soluble expression ofM.tuberculosisproteins provides a screening platform for the rapid high-throughput soluble expression ofM.tuberculosisrecombinant proteins and will facilitate the structural and functional studies ofM.tuberculosisproteins, especially the proteins targeted by the important drugs.

Mycobacteriumtuberculosis； Recombinant fusion proteins； High-throughput screening assays

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.05.004

中國(guó)科學(xué)院科技網(wǎng)絡(luò)服務(wù)計(jì)劃(STS計(jì)劃) (KFJ-EW-STS-028)； 廣東省引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 (2013S024)；佛山市科技創(chuàng)新基金(2013HT100103)

325005 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院、生命科學(xué)院 [許靜(研究生)、畢利軍(兼職教授)]；中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所(畢利軍)；佛山市廣東體必康生物科技有限公司(任百光、 程海麗、劉懷鈺、魏文豐、鄧?yán)势?、封勝?

畢利軍， Email：blj@ibp.ac.cn

2015-03-30)