柞蠶蛹發(fā)育過程中生理活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)的變化研究

孟 楠 都興范 溫志新 李亞潔 馬淑慧 李學(xué)軍

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連 116024）

柞蠶蛹發(fā)育過程中生理活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)的變化研究

孟 楠 都興范 溫志新 李亞潔 馬淑慧 李學(xué)軍

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連 116024）

為探討柞蠶蛹的利用價(jià)值，研究了柞蠶蛹部分生理活性物質(zhì)及蛋白質(zhì)等隨著發(fā)育進(jìn)程的變化關(guān)系。結(jié)果表明：在有效積溫為130℃時(shí)，柞蠶蛹血淋巴中溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力達(dá)到最高值，分別為0.82 U／mL和70.58 U／mL；在有效積溫為90℃時(shí)，誘導(dǎo)抗菌活性物質(zhì)的活力達(dá)到最高值，抑菌圈直徑為2.89 mm；在有效積溫為150℃時(shí)，磷脂的含量達(dá)到最大值，每克鮮蛹為44.5 mg；在滯育期（0℃）時(shí)，游離氨基酸的含量達(dá)到最大值，每毫升血淋巴為16.32 mg；蛋白質(zhì)種類和含量以發(fā)育中期（在有效積溫為150℃）時(shí)最多。

柞蠶蛹；發(fā)育；有效積溫；生理活性物質(zhì)；蛋白質(zhì)；變化

柞蠶（Antheraea Pernyi）是完全變態(tài)昆蟲，其個(gè)體發(fā)育經(jīng)歷卵、幼蟲（蠶）、蛹和成蟲（蛾）4個(gè)在形態(tài)和生理上完全不同的發(fā)育階段，柞蠶蛹是柞蠶幼蟲向成蟲變態(tài)的過渡階段，體內(nèi)積累了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)［1］。目前，對(duì)柞蠶蛹營養(yǎng)成分分析及柞蠶幼蟲不同發(fā)育時(shí)期黃酮和糖類等物質(zhì)的變化研究已有報(bào)道［2-4］，但有關(guān)柞蠶蛹發(fā)育過程中生理活性物質(zhì)的變化研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本研究對(duì)柞蠶蛹發(fā)育過程中的溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、磷脂等活性成分以及蛋白質(zhì)與有效積溫的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系進(jìn)行了研究分析，以期為柞蠶蛹期發(fā)育、免疫防御機(jī)制及活性成分的高效利用提供理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試柞蠶繭品種：抗大，由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所提供。

主要儀器和試劑：V-5000型可見光分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司生產(chǎn)；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；Powerpac電泳儀，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。溶菌酶和超氧化物歧化酶活性檢測(cè)試劑盒，由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；溶壁微球菌干粉，購自于中國科學(xué)院微生物研究所；聚丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、磷酸二氫鉀等其余試驗(yàn)試劑均為市售分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柞蠶蛹加溫處理 將處于滯育期的柞蠶繭在0～4℃條件下儲(chǔ)存50 d，待其解除滯育后，將柞蠶繭放置在塑料盒內(nèi)進(jìn)行加溫，按照柞蠶蛹發(fā)育的起點(diǎn)溫度10℃［1］，計(jì)算每天的有效積溫：第1、2天溫度為15℃，每天的有效積溫為5℃；從第3天開始溫度升為20℃，每天的有效積溫為10℃，相對(duì)濕度均保持在65%～80%，直至羽化出蛾。

1.2.2 柞蠶蛹血淋巴樣品采集 取不同有效積溫的雌雄柞蠶蛹各10頭，采集血淋巴混勻后于100℃水浴中加熱5 min，12 000 r／min離心10 min，取上清液備用。

1.2.3 柞蠶鏈球菌及菌液的制備 柞蠶鏈球菌為本實(shí)驗(yàn)室分離保存，菌液制備方法如下：在無菌條件下取指數(shù)生長期（用接種環(huán)從斜面上取一環(huán)菌種，接到鏈球菌培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～20 h，次日轉(zhuǎn)管繼續(xù)培養(yǎng)6～7 h）的柞蠶鏈球菌菌液，用0.9%生理鹽水稀釋至20倍液，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，備用。

1.2.4 柞蠶蛹抗菌活性物質(zhì)的誘導(dǎo) 取不同有效積溫的雌雄柞蠶蛹各20頭，用無菌的微量注射器從蠶蛹節(jié)間膜處注入柞蠶鏈球菌菌液（菌液濃度為104～106個(gè)／mL），按50 uL／頭的劑量注射；置于22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后采集血淋巴，100℃水浴中加熱5 min，12 000 r／min離心10 min，取上清液用于抗菌活性物質(zhì)的活性測(cè)定。

1.2.5 溶菌酶的活性測(cè)定 參照Hultmark等［5］的方法測(cè)定。以溶壁微球菌凍干粉為底物，將底物用0.1 mol／L、pH值6.4的磷酸鉀鹽緩沖液配成菌懸液，取3 mL制備的溶壁微球菌菌懸液于試管內(nèi)，冰浴10 min，然后加入100 uL不同有效積溫條件下的待測(cè)血淋巴，振蕩混勻，于分光光度計(jì)570 nm波長處測(cè)定其吸光度值（A0），然后將試管移入37℃水浴中放置30 min，取出后立即置于冰浴中10 min后終止反應(yīng)，測(cè)其吸光度值（A）。溶菌酶活力（UL）計(jì)算公式：溶菌酶活力（U／mL）＝（A0-A）／A。

在不同的有效積溫條件下，柞蠶蛹血淋巴超氧化物歧化酶活力定義為：每毫升反應(yīng)液中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的超氧化物歧化酶的量為1個(gè)超氧化物歧化酶活力單位（U）。

1.2.7 抗菌活性物質(zhì)的活性測(cè)定 采用抑菌圈法［6-7］測(cè)定。將經(jīng)過高壓滅菌的LB瓊脂培養(yǎng)基，在無菌條件下取10 mL于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中做成平板，凝固后在無菌條件下打孔，孔徑2.7 mm。取1.2.4項(xiàng)誘導(dǎo)免疫后的柞蠶蛹血淋巴上清液5μL點(diǎn)到孔中，于4℃下放置2 h，然后轉(zhuǎn)到37℃下培養(yǎng)18 h后取出觀察，并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.8 磷脂、游離氨基酸含量的測(cè)定 根據(jù)GB／T 5537—2008糧油檢驗(yàn)磷脂含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)［8］測(cè)定柞蠶蛹磷脂的含量，根據(jù)GB／T 5009.124—2003食品中氨基酸的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)［9］測(cè)定游離氨基酸的含量。

1.2.9 蛋白質(zhì)種類和含量的電泳分析 將不同發(fā)育時(shí)期雌雄柞蠶蛹血淋巴樣品，用5%濃縮膠和12%分離膠在電壓（80～120 V）的條件下進(jìn)行聚丙酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色30 min后于冰醋酸中脫色，然后進(jìn)行觀察分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柞蠶蛹發(fā)育過程中溶菌酶的活性變化

從柞蠶蛹血淋巴中溶菌酶活性與有效積溫的關(guān)系（圖1）可以看出，柞蠶蛹在滯育期血淋巴溶菌酶活力最低，為0.43 U／mL；隨著柞蠶蛹感受有效積溫的增加逐漸升高，當(dāng)有效積溫達(dá)到130℃時(shí)溶菌酶活力達(dá)到最高值，為0.82 U／mL，是最低值的1.91倍；隨后逐漸下降，羽化前接近最低值。

圖1 柞蠶蛹血淋巴中溶菌酶活性與有效積溫的關(guān)系

2.2 柞蠶蛹發(fā)育過程中超氧化物歧化酶的活性變化

從柞蠶蛹血淋巴中超氧化物歧化酶活性與有效積溫的關(guān)系（圖2）可以看出，有效積溫從0℃至130℃時(shí)，隨著有效積溫的增加，柞蠶蛹血淋巴中超氧化物歧化酶的活力也在逐漸提高，至130℃時(shí)活力達(dá)到最高值70.58 U／mL，隨后急劇下降，至羽化前（210℃）達(dá)到最低值42.04U／mL。在柞蠶蛹發(fā)育過程中，超氧化物歧化酶活力最高值是最低值的1.68倍。

圖2 柞蠶蛹血淋巴中超氧化物歧化酶活性與有效積溫的關(guān)系

2.3 柞蠶蛹發(fā)育過程中血淋巴抗菌活性物質(zhì)的活性變化

從柞蠶蛹發(fā)育過程中誘導(dǎo)血淋巴抗菌活性物質(zhì)的活性與有效積溫的關(guān)系（圖3）可以看出，有效積溫從0℃至90℃時(shí)，隨著積溫的逐漸增加，柞蠶蛹血淋巴中抗菌活性物質(zhì)的活性也在逐漸提高，至90℃時(shí)活性達(dá)到最高，抑菌圈直徑為11.65 mm；隨后血淋巴中抗菌活性物質(zhì)的活性急劇下降，羽化前（180℃）抑菌活性降至最低，其抑菌圈直徑為2.89 mm。在柞蠶蛹發(fā)育過程中誘導(dǎo)的血淋巴抗菌活性物質(zhì)的活性，最高值是最低值的4.03倍。

圖3 柞蠶蛹發(fā)育過程中誘導(dǎo)血淋巴抗菌活性物質(zhì)的活性與有效積溫的關(guān)系

2.4 柞蠶蛹發(fā)育過程中磷脂含量的變化

從柞蠶蛹發(fā)育過程中磷脂含量與有效積溫的關(guān)系（圖4）可以看出，處于滯育期的柞蠶蛹磷脂含量最低，每克鮮蛹為38.3 mg，隨著有效積溫的增加，柞蠶蛹中的磷脂含量也在逐漸升高，至150℃時(shí)達(dá)到最高值，每克鮮蛹為44.5 mg，隨后逐漸降低。在柞蠶蛹發(fā)育過程中，磷脂含量的最高值是最低值的1.16倍。

圖4 柞蠶蛹發(fā)育過程中磷脂含量與有效積溫的關(guān)系

2.5 柞蠶蛹發(fā)育過程中游離氨基酸含量的變化

從柞蠶蛹游離氨基酸含量與有效積溫的關(guān)系（表1）可以看出，在柞蠶蛹4個(gè)不同發(fā)育階段中，以柞蠶蛹滯育期（0℃）的氨基酸總量最高，每毫升血淋巴為16.32mg；隨著有效積溫的增加，氨基酸總量逐漸降低，至210℃時(shí)降至最低，每毫升血淋巴為8.63mg，滯育期的氨基酸總量是發(fā)育后期的1.89倍。4個(gè)不同發(fā)育階段必須氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（EAA／TAA），分別為0.37、0.34、0.35和0.37。另外，不同發(fā)育時(shí)期的柞蠶蛹血淋巴中均含有16種游離氨基酸，其中，以脯氨酸（2.48 mg／mL）、蘇氨酸（1.79 mg／mL）、丙氨酸（1.70 mg／mL）、組氨酸（1.61 mg／mL）、精氨酸（1.41 mg／mL）和賴氨酸（1.34 mg／mL）的含量較高；而且有10種氨基酸的含量隨著有效積溫的增加而降低，其余6種呈波動(dòng)性變化。

表1 柞蠶蛹游離氨基酸含量與有效積溫的關(guān)系（mg／m L）

2.6 柞蠶蛹發(fā)育過程中蛋白質(zhì)含量的變化

由柞蠶蛹發(fā)育過程中血淋巴蛋白質(zhì)的電泳圖譜（圖5）可以看出，柞蠶蛹發(fā)育過程中蛋白質(zhì)具有多樣性，成分比較復(fù)雜，柞蠶蛹滯育期（0℃）和發(fā)育前期（70℃）血淋巴中蛋白質(zhì)種類均較少，而且蛋白質(zhì)含量較低；隨著有效積溫的增加，至發(fā)育中期（150℃）蛋白質(zhì)種類和含量明顯增加，表現(xiàn)為蛋白條帶增多，顏色加重；發(fā)育后期（210℃）蛋白質(zhì)種類和含量又逐漸減少和降低。在4個(gè)發(fā)育階段，以分子量約為85 kD的蛋白質(zhì)含量變化最為明顯。

圖5 柞蠶蛹發(fā)育過程中血淋巴蛋白質(zhì)的電泳圖譜

3 討論

科學(xué)研究表明，昆蟲體內(nèi)的溶菌酶屬于C型溶菌酶，這類蛋白酶可使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂后內(nèi)容物外溢，從而導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡，因此在昆蟲的免疫防御體系中起著十分重要的作用［10］；超氧化物歧化酶作為一種保護(hù)酶，可清除生物體代謝過程中產(chǎn)生的超氧自由基，保護(hù)機(jī)體免受毒害［11］；而磷脂作為生物細(xì)胞不可缺少的成分，具有促進(jìn)大腦發(fā)育，增強(qiáng)智力和防治老年性癡呆癥等作用［12］。本研究表明，柞蠶蛹感溫發(fā)育階段含有溶菌酶、超氧化物歧化酶和磷脂等活性成分，且3種活性成分合成高峰期的有效積溫分別為130、130、150℃，成分含量最高值分別是最低值的1.91倍、1.68倍、1.16倍，說明柞蠶蛹在發(fā)育過程中其生理活性物質(zhì)含量的變化較大，為柞蠶蛹期活性成分的有效利用提供了理論依據(jù)。

昆蟲的免疫應(yīng)答是非專一性的，用柞蠶鏈球菌、大腸桿菌等誘導(dǎo)柞蠶蛹后可合成一系列抗菌活性物質(zhì)，這些物質(zhì)主要包括抗菌肽、溶菌酶和凝集素等多種活性成分［13］；同時(shí)，昆蟲不同發(fā)育時(shí)期的抗菌活性差別與其免疫防御系統(tǒng)有關(guān)［14］。本試驗(yàn)利用柞蠶鏈球菌誘導(dǎo)不同發(fā)育時(shí)期的柞蠶蛹發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中期和前期的柞蠶蛹抗菌活性較高，發(fā)育后期的活性急劇下降。推測(cè)可能與發(fā)育中期和前期柞蠶蛹的免疫應(yīng)答能力較強(qiáng)有關(guān)。

昆蟲血淋巴中含有大量的游離氨基酸，其含量通常為脊椎動(dòng)物血液中的50倍左右。這些氨基酸除作為合成蛋白質(zhì)的物質(zhì)外，還可能有一些特殊的功能，如滲透壓的調(diào)節(jié)、廢物的解毒、特殊條件下的能量來源及參與形態(tài)變異和生殖過程［15］。本試驗(yàn)中，隨著柞蠶蛹的發(fā)育（有效積溫的增加），游離氨基酸總量逐漸降低。這可能是由于柞蠶蛹解除滯育后發(fā)育至成蟲階段，需要消耗大量的游離氨基酸，致使氨基酸總量下降所致。

柞蠶蛹在發(fā)育過程中，雖然表面靜止不動(dòng)，但蛹體內(nèi)卻進(jìn)行著劇烈的組織解離和組織發(fā)生過程［1］。試驗(yàn)結(jié)果表明，處于發(fā)育中期的柞蠶蛹生理活性物質(zhì)含量普遍較高，蛋白質(zhì)種類和含量變化明顯，這一變化是否與柞蠶蛹的發(fā)育機(jī)制有關(guān)尚有待于進(jìn)一步的研究分析。

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S885.1

A

1007-0982（2015）03-0024-05

2015-04-10；接受日期:2015-05-25

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金（編號(hào)2014002007）；遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)2014209001）。

孟楠（1980—），女，遼寧沈陽，本科，助理研究員。Tel：0411-84790092，E?mail：mona0408＠163.com

都興范（1969—），男，遼寧丹東，碩士，研究員。Tel：0411-84790092，E?mail：dxfan68＠126.com